吳紹燕，任 磊△，王永紅，羅 蓉，向 瑜

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院:1.健康體檢部;2.檢驗(yàn)科 400016)

幽門螺桿菌感染是慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍、淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。自澳大利亞學(xué)者巴里·馬歇爾和羅賓·沃倫發(fā)現(xiàn)并證明幽門螺桿菌感染胃部會(huì)導(dǎo)致胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃淋巴瘤甚至胃癌以來(lái),幽門螺桿菌掀起了全世界的研究熱潮。1994年WHO將幽門螺桿菌列為第1類高危致惡變因子，幽門螺桿菌具有極強(qiáng)的傳染性，人是幽門螺桿菌的惟一傳染源[1]。大量研究表明，超過90%的十二指腸潰瘍和80%左右的胃潰瘍，都是由幽門螺桿菌感染導(dǎo)致的，在我國(guó)胃癌的死亡率占所有惡性腫瘤的23.02%[2]。絕大多數(shù)幽門螺桿菌感染者不會(huì)發(fā)展成為消化性潰瘍和胃癌，這與感染菌株的型別、宿主基因型的差異及所暴露的環(huán)境因素有關(guān)。IL-10是重要的抗炎細(xì)胞因子，在胃癌患者中IL-10的表達(dá)量減少[3]。在人群中，IL-10基因型等遺傳因素會(huì)影響幽門螺桿菌感染者發(fā)展成為胃癌的危險(xiǎn)性。

IL-10基因在啟動(dòng)子區(qū)-1082 G/A、-819 C/T和-592 C/A存在基因多態(tài)性[4]。本研究從宿主的角度討論幽門螺桿菌感染后IL-10基因型與胃癌易感性的關(guān)系,旨在尋找胃癌發(fā)生的易感基因型，為胃癌的預(yù)防及治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2010～2013年住院患者中胃癌且伴有幽門螺桿菌感染者作為胃癌組(n=100)，同時(shí)選取本院2010～2013年體檢者中的幽門螺桿菌感染者作為相應(yīng)的對(duì)照組(n=140)，與志愿者簽署知情同意書，同時(shí)取得本院倫理委員會(huì)同意。胃癌組：男39例，女61例，年齡(47.02±14.48)歲；所有患者均行胃鏡檢查，胃癌的診斷均通過組織病理學(xué)確診。對(duì)照組：男68例，女72例，年齡(45.69±16.19)歲，無(wú)胃潰瘍及胃癌的病史。所有研究對(duì)象均為漢族，相互間無(wú)血緣關(guān)系。

1.2材料 胃幽門螺桿菌抗體檢測(cè)試劑盒(廣州健倫生物科技有限公司)；快速檢測(cè)試紙(北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司)；DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)DL2000和限制性內(nèi)切酶RsaⅠ(大連寶生物公司)；IL-10-592引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1幽門螺桿菌感染的檢測(cè) 胃癌組采取快速檢測(cè)試紙(尿素酶試紙片)法，對(duì)照組采取C13呼氣試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)；上述兩組研究者均提取血清，并采用膠體金技術(shù)定性檢測(cè)。

1.3.2細(xì)胞因子基因多態(tài)性檢測(cè)

1.3.2.1DNA模板的制備 取所有受試者靜脈血3 mL，EDTA-Na2抗凝，用改良碘化鈉法[5]提取白細(xì)胞DNA，在-20 ℃條件下保存。

1.3.2.2引物的設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)檢測(cè)IL-10-592的引物,正向引物:5′-CCT AGG TCA CAG TGA CGT GG-3′,反向引物:5′-GGT GAG CAC TAC CTG ACT AGC-3′。

1.3.2.3限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR(PCR-RFLP)的反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)體系中包括10 μL Premix Taq (dNTP，Taq DNA聚合酶，Mg2+)，4 μL DNA模板，引物5 pmol，加去離子水至20 μL[6]。檢測(cè)IL-10-592基因的PCR條件:94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35 個(gè)循環(huán)。

1.3.2.4酶切產(chǎn)物檢測(cè)及分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由限制性內(nèi)切酶在37 ℃水浴箱進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldview染色后用凝膠成像儀進(jìn)行觀察，同時(shí)分析DNA條帶[6]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各基因型以及等位基因頻率用頻數(shù)計(jì)算，然后通過H-W遺傳平衡定律進(jìn)行檢驗(yàn)。胃癌組與對(duì)照組之間的比較用χ2檢驗(yàn)。各基因型發(fā)生胃癌和胃潰瘍的危險(xiǎn)性用優(yōu)勢(shì)比(OR)以及95%CI來(lái)表示，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1基因多態(tài)性的檢測(cè)結(jié)果IL-10-592 PCR產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶RsaⅠ酶切后進(jìn)行電泳分型，其基因型分別為：A/A型 236 bp 和176 bp,C/C型412 bp,A/C型412、236、176 bp,見圖1。

1、4:IL-10-592A/A型；2、5:IL-10-592C/C型；3、6:IL-10-592A/C型；Marker：DNA分子標(biāo)記物。

圖1IL-10-592基因多態(tài)性的檢測(cè)結(jié)果

2.2各基因型分布頻率χ2檢驗(yàn)表明，3種基因型以及等位基因頻率均符合H-W遺傳平衡，且具有群代表性。在胃癌組中IL-10-592的各基因型的頻率(A/A型26%，A/C型40%,C/C型34%)與對(duì)照組(A/A型10%，A/C型33%,C/C型 57%)比較，分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.36,P<0.01)。見表1。

表1 各基因型分布頻率[n(%)]

2.3IL-10-592各基因型胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)性分析 本研究中，應(yīng)變量Y表示是否患病以及患何種疾?。簩?duì)照以Y=0 表示，胃癌用Y=1來(lái)表示；IL-10-592的基因型以自變量X1表示：C/C型用X1=1表示，A/C型用X1=2表示，A/A型用X1=3表示；建立Logistic回歸模型，分析IL-10-592 各基因型發(fā)生胃癌的危險(xiǎn)性。與攜帶IL-10-592C/C者比較，攜帶IL-10-592A/A者發(fā)生胃癌的危險(xiǎn)性為OR=4.37(95%CI:2.04～9.38),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。攜帶IL-10-592A/C者發(fā)生胃癌的危險(xiǎn)性為OR=2.05 (95%CI:1.14～3.67),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

幽門螺桿菌能夠促使胃黏膜上的炎性細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致胃、十二指腸的炎癥加重，引起黏膜損傷，胃酸分泌異常。目前胃癌的發(fā)病機(jī)制并未完全闡明，Toller等[7]發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌使胃黏膜細(xì)胞發(fā)生致死性損傷(即DNA雙鏈斷鏈)，與胃癌的發(fā)生相關(guān)。目前研究表明在幽門螺桿菌引起的胃癌中，幽門螺桿菌感染、遺傳因素、環(huán)境因素在這個(gè)過程中均起到了相關(guān)的作用。宿主遺傳因素，包括基因多態(tài)性、HLA基因型等可能影響到幽門螺桿菌相關(guān)性胃、十二指腸疾病的易感性。隨著基因組學(xué)的進(jìn)步，基因組不穩(wěn)定性在胃癌中的作用日益顯現(xiàn)，包括基因的缺失、癌基因的激活和抑癌基因功能的喪失等[8]。近年來(lái)細(xì)胞因子的基因多態(tài)性對(duì)幽門螺桿菌感染的影響已成為研究的熱點(diǎn)。IL-10是參與抗炎重要的細(xì)胞因子，它的表達(dá)量減少會(huì)促使IL-1、TNF-α等促炎因子的表達(dá)增加，IL-1、TNF-α等促炎因子能夠抑制胃酸的分泌，有利于幽門螺桿菌在胃黏膜內(nèi)定植，從而導(dǎo)致胃、十二指腸疾病的發(fā)生[9]。

基因多態(tài)性可表現(xiàn)為單核苷酸多態(tài)性(SNP)，不同物種、個(gè)體基因組DNA序列同一位置上的單個(gè)核苷酸存在差別的現(xiàn)象。有這種差別的基因座、DNA序列等可作為基因組作圖的標(biāo)志，其中有些SNP可能與疾病有關(guān)，尋找這些特定的SNP是發(fā)現(xiàn)相關(guān)疾病易感基因的重要途徑[10]。IL-10的基因多態(tài)性與幽門螺桿菌感染導(dǎo)致胃癌的關(guān)系還未完全明確。El-Omar等[11]對(duì)賁門癌和非賁門癌患者進(jìn)行IL-10等細(xì)胞因子基因多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-10的低表達(dá)，最終導(dǎo)致了胃癌的發(fā)生。與攜帶IL-10-592C/C者比較，攜帶IL-10-592A/A者發(fā)生胃癌的危險(xiǎn)性為OR=4.37(95%CI:2.04～9.38)，在胃癌組中A等位基因頻率高于對(duì)照組，提示IL-10基因多態(tài)性與幽門螺桿菌相關(guān)的胃癌相關(guān)[12]，IL-10-592是幽門螺桿菌相關(guān)的胃癌的易感基因。攜帶IL-10-592A/A基因型患者表達(dá)IL-10減少，IL-10的抗炎作用減弱，IL-1等促炎因子表達(dá)增加，加重了胃黏膜的炎性反應(yīng)，也利于幽門螺桿菌在胃內(nèi)的定植，從而為胃癌的發(fā)生提供了有利條件[13]。Lee等[14]對(duì)胃癌、消化性潰瘍患者進(jìn)行研究，研究中發(fā)現(xiàn)IL-10-1082、-592兩個(gè)位點(diǎn)基因型在胃癌、消化性潰瘍、對(duì)照組之間并無(wú)顯著性差異，與幽門螺桿菌感染程度、胃癌發(fā)生的部位、胃癌家族史之間無(wú)相關(guān)性，認(rèn)為IL-10-1082、-592基因多態(tài)性與韓國(guó)人群發(fā)生胃癌無(wú)關(guān)。本研究的結(jié)果與其他研究結(jié)果之間的差異，原因可能是研究對(duì)象的遺傳背景不同。

[1]Pounder RE,Ng D.The prevalence of Helicobacter Pylori infection in different countries[J].Aliment Pharmacol Ther,1995,9(2):33-39.

[2]韓鋒產(chǎn)，閻小君，蘇成芝．幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A及細(xì)胞空泡毒素A的研究[J]．華人消化雜志，1998，6(2)：72-73．

[3]吳迪，李玉民，曹文娟，等.白細(xì)胞介素10-1082基因多態(tài)性與胃癌遺傳易感性的Meta分析[J].中華消化外科雜志，2014，13(1)：34-38.

[4]Turner DM,Williams DM,Sankaran D,et al.An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter[J].Eur J Immunogenet,1997,24(1):1-8.

[5]李艷，黃憲章，張平安，等．雌激素受體基因多態(tài)性與急性心肌梗死關(guān)系的研究[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志，2001，81(7)：8-11．

[6]向瑜，張莉萍，陳瀑，等．白介素-1和腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性與幽門螺桿菌相關(guān)性胃十二指腸疾病的關(guān)系[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22(7)：609-613．

[7]Toller IM,Neelsen KJ,Steger M,et al.Carcinogenic bacterial pathogen Helicobacter pylori triggers DNA double-strand breaks and a DNA damage response in its host cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(36):14944-14949.

[8]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[9]Lee JY,Kim HY,Kim KH,et al.Association of polymorphism of IL-10 and TNF-A genes with gastric cancer in Korea[J].Cancer Lett,2005,225(2):207-214.

[10]Lu W,Pan K,Zhang L,et al.Genetic Polymorphisms of interleukin(IL)-1B,IL-1RN,IL-8,IL-10 and tumor necrosis factor alpha and risk of gastric cancer in a Chinese population[J].Carcinogenesis,2005,26(3):631-636.

[11]El-Omar EC,Gammon MD.Increased risk of noncardia gastric cancer associated with proinflammatory cytokine gene polymorphisma[J].Gastroenterology,2003,124(5):1193-1201.

[12]Rad R,Dossumbekova A,Neu B,et al.Cytokine gene polymorphisms influence mucosal cytokine expression,gastric inflammation,and host specific colonisation during Helicobacter pylori infection[J].Gut,2004,53(8):1082-1089.

[13]Roh JW,Kim MH,Seo SS,et al.Interleukin-10 promoter polymorphisms and cervical cancer risk in Korean women[J].Cancer Lett,2002,184(1):57-63.

[14]Lee KM,Lee JS,Jung HS,et al.Late reactivation of sonic hedgehog by Helicobacter pylori results in population of gastric epithelial cells that are resistant to apoptosis:implication for gastric carcinogenesis[J].Cancer Lett,2010,287(1):44-53.