劉 濤，張 偉，劉 娟，張 磊，周清波

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)教研室，上海 200433)

地龍是一味傳統(tǒng)動(dòng)物類中藥，具有清熱定驚，通絡(luò)平喘，利尿等功效。根據(jù)《中國藥典》2010年版的記載，環(huán)節(jié)動(dòng)物門寡毛綱動(dòng)物地龍分為參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)、通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen)或櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥體。前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三種習(xí)稱“滬地龍”[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，有溶栓、抗菌、抗腫瘤等作用，并廣泛應(yīng)用于臨床[2]。此外，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、農(nóng)業(yè)、治理環(huán)境污染、食品等方面均具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。隨著地龍及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，其原動(dòng)物及藥材需求量正逐年快速增長。產(chǎn)自上海的滬地龍藥用價(jià)值較高，是公認(rèn)的道地藥材，但目前市面上滬地龍藥材來源比較復(fù)雜，優(yōu)劣品種混雜，特別是經(jīng)過加工或者炮制過的地龍藥材，采用一般的傳統(tǒng)地龍藥材鑒別方法很難對(duì)其種源品質(zhì)等方面進(jìn)行正確的鑒別分析，嚴(yán)重影響了地龍藥材的應(yīng)用與開發(fā)。

簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增(inter-simplesequence repeat,ISSR)是一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上建立反應(yīng)體系，與以往的隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)DNA(random amplified pdymorphic DNA,RAPD)、簡單重復(fù)序列(simplesequence repeat,SSR)標(biāo)記技術(shù)相比，ISSR能夠提供更多、更穩(wěn)定可靠，重復(fù)性更好的基因組DNA信息[4]。目前在品種鑒定[5]、多樣性分析[6，7]等方面均有廣泛的應(yīng)用研究。

現(xiàn)采用單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)影響其鑒定結(jié)果的各影響因子進(jìn)行分析篩選，從而建立最佳地龍ISSR-PCR體系，為深入研究地龍藥材的遺傳多樣性提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的原材料為新鮮動(dòng)物威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)，采自上海市第二軍醫(yī)大學(xué)藥用植物園，取新鮮地龍10條，將其編號(hào)，液氮速凍后置于-70℃超低溫冰箱備用，用于基因組DNA的提取及ISSR-PCR研究?；蚪MDNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司(批號(hào)：DP304)；Premix Taq聚合酶(批號(hào)：R004A)與DL2000 DNA Marker(批號(hào)：3427B)均購自寶生物工程(大連)有限公司；ISSR引物序列來自University of British Columbia發(fā)布的100個(gè)序列[8]，由上海生工生物工程有限公司合成；50×TAE緩沖液由上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA的提取與檢測(cè)

將置于-70℃超低溫冰箱中的速凍地龍樣本放入盛有液氮的研缽中，快速研磨至粉末狀，按照基因組DNA提取試劑盒提供的提取步驟對(duì)其進(jìn)行DNA提取，提取完畢，經(jīng)過0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行130V電壓電泳檢測(cè)30min，以此來判斷提取的DNA樣本是否降解，篩選有清晰條帶的樣本作為備用。使用紫外分光光度法，測(cè)定波長在260nm和280nm處的吸光度，估測(cè)DNA樣本質(zhì)量，檢測(cè)λ260/.λ280值是否符合實(shí)驗(yàn)要求(1.6～1.8)，將篩選好的樣本稀釋至50μg/μL的樣本保存在-20℃冰箱內(nèi)，為ISSR-PCR反應(yīng)備用。

2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系建立

此次試驗(yàn)應(yīng)考慮的不穩(wěn)定性因素有ISSR引物、Taq聚合酶、模板DNA，通過對(duì)各因素的處理與優(yōu)化，從而確定ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系。反應(yīng)體系和初始程序參照文獻(xiàn)[9]，總反應(yīng)體系為20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變5min；94℃變性30s，54.6℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)38次；72℃延伸10min，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過1.6%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳緩沖液為1×TBE，在50V電壓下電泳140min左右，溴化乙錠(EB)染色30min，DNA Marker(DL2000)標(biāo)記，用紫外線凝膠成像分析儀(購自上海培清科技有限公司)觀測(cè)，拍照，保存。

2.3 模板DNA濃度的優(yōu)化

隨機(jī)選取同一解鏈溫度(Tm=52.2℃)的8個(gè)引物用作反應(yīng)引物(UBC#807、#812、#813、#816、#819、#822、#825、#828)，設(shè)定模板DNA濃度為50、25、10 μg/μL作為待篩選的模板DNA樣本，經(jīng)觀察對(duì)比獲取模板DNA最佳濃度。

2.4 引物的篩選及其退火溫度的優(yōu)化

將篩選好的模板DNA濃度作為體系最佳模板DNA濃度，對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果選擇ISSR-PCR反應(yīng)體系最佳引物，同時(shí)利用最佳體系對(duì)ISSR引物退火溫度進(jìn)行梯度試驗(yàn)，梯度溫度設(shè)定在引物解鏈溫度上下浮動(dòng)3℃，對(duì)每個(gè)退火溫度梯度擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行觀察對(duì)比，確定ISSR引物最佳退火溫度。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

另取10份同種地龍?jiān)瓌?dòng)物模板DNA對(duì)ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)程序同上。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 模板DNA不同濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

如圖1所示，第1、4、7、10、13、16、19、22號(hào)均未有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，表明ISSR反應(yīng)體系在模板DNA濃度為50 μg/μL時(shí)均沒有發(fā)生擴(kuò)增；第2、5、8、11、14、17、20、23號(hào)均能產(chǎn)生條帶，但清晰度與特異性較低；第3、6、9、12、15、18、21、24號(hào)擴(kuò)增的條帶清晰度最好，特異性高，因此，確定10 μg/μL為ISSR反應(yīng)體系模板DNA最佳濃度。

3.2 ISSR引物的篩選以及其退火溫度的優(yōu)化

以圖2為例，由圖可知，第13號(hào)和第18號(hào)均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，第4、10、15、16、17號(hào)有較少的擴(kuò)增條帶，第1、3、5、6、12、14號(hào)有擴(kuò)增條帶，但背景不清晰，多態(tài)性低，第2、9、11號(hào)擴(kuò)增的條帶背景清晰，多態(tài)性高，特異性好，因此第2號(hào)的引物807、第9號(hào)引物825和第11號(hào)的引物810被選為ISSR最佳引物，最適退火溫度分別為52.2、55.2、52.2℃。經(jīng)篩選，確定引物807、810、818、825、826、827、829為ISSR反應(yīng)最佳引物，以及最佳引物的最佳退火溫度，見表1。

M-Marker DL 2000；1～3、4～6、7～9、10～12、13～15、16～18、19～21、22～24對(duì)應(yīng)的引物分別是807、812、813、816、819、822、825、828

1、4、7、10、13、16、19、22對(duì)應(yīng)的DNA濃度為 50μg/μL，2、5、8、11、14、17、20、23是25 μg/μL，3、6、9、12、15、18、21、24對(duì)應(yīng)的是10 μg/μL

圖1 模板DNA不同濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

M-Marker DL2000；1～3、4～6、7～9、10～12、13～15、16～18對(duì)應(yīng)的引物分別是807、816、825、810、814、817

1、4、7、10、13、16對(duì)應(yīng)的退火溫度為49.2℃，2、5、8、11、14、17為52.2℃，3、6、9、12、15、18為55.2℃

表1 ISSR-PCR反應(yīng)最佳引物及其最佳退火溫度

3.3 最佳反應(yīng)體系的穩(wěn)定性分析

根據(jù)確定的ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，用10個(gè)同種地龍模板DNA進(jìn)行穩(wěn)定性分析試驗(yàn)，從圖3的結(jié)果來看，確定的ISSR最佳反應(yīng)體系穩(wěn)定性高，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用。

M-Marker DL2000

4 討論

ISSR分子標(biāo)記鑒定技術(shù)作為一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性水平高，重復(fù)性好，安全性高，成本低的特點(diǎn)，雖然比其他鑒定分析技術(shù)更有準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，但仍存在多種不穩(wěn)定性因素(ISSR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA)影響著鑒定結(jié)果，因此在選用ISSR分子鑒定前期，應(yīng)考慮分析各影響因素，篩選ISSR反應(yīng)最佳引物，摸索ISSR引物最佳退火溫度，從而確立地龍ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系。

本實(shí)驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)建立了ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，通過篩選最佳引物及摸索其最佳退火溫度，從而將ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)一步優(yōu)化。最佳反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積20μL，其中有10U Taq酶，0.8μmol/L引物，10ng/μL 模板DNA，加滅菌水補(bǔ)足至20μL，引物UBC807、UBC810、UBC818、UBC825、UBC826、UBC827、UBC829為ISSR反應(yīng)最適引物，最適退火溫度分別為52.2、52.2、55.2、55.2、54.6、54.6、54.6℃。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模板DNA濃度、引物及其退火溫度的選擇對(duì)ISSR反應(yīng)結(jié)果有著重要的影響，為后續(xù)ISSR技術(shù)開展地龍遺傳多樣性的實(shí)驗(yàn)研究提供了依據(jù)。

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