趙 光 李 珺* 杜雪靜

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析木瓜中綠原酸與抗癌活性成分的相關(guān)性研究*

趙 光①李 珺①*杜雪靜①

目的：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)分析木瓜中綠原酸與抗癌活性成分的相關(guān)性。方法：采用HPLC-MS聯(lián)用法，在Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫；流速為0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm；柱溫為25 ℃。分離測(cè)定木瓜中綠原酸的含量。結(jié)果：木瓜中綠原酸的含量為1.3 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.4%，線(xiàn)性關(guān)系良好。結(jié)論：木瓜中含有綠原酸，其主要成分與木瓜對(duì)脂肪酸合酶(FAS)的抑制及抗腫瘤作用有潛在的相關(guān)性。

木瓜；高效液相色譜-質(zhì)譜；綠原酸

趙光，女，(1961- )，碩士，副教授。首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院，從事醫(yī)藥化學(xué)教學(xué)與天然藥物科研工作。

木瓜(Chaenomeles speciosa sweet nakai)為薔薇科植物貼梗海棠的干燥近成熟果實(shí)，習(xí)稱(chēng)“皺皮木瓜”，主產(chǎn)于我國(guó)安徽、山東、浙江、河南、湖北及西南地區(qū)[1]。木瓜有舒筋、活絡(luò)、健脾開(kāi)胃、舒肝止痛及祛風(fēng)除濕等功效，臨床可用于預(yù)防和治療風(fēng)濕病、霍亂、痢疾、腸炎、腳氣病及維生素C缺乏癥等。研究表明，木瓜提取物有抗菌、鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗腫瘤等新的活性[2-3]。

木瓜的營(yíng)養(yǎng)成分非常豐富，含有糖類(lèi)、蛋白質(zhì)及氨基酸類(lèi)、脂質(zhì)及脂肪酸類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、水溶性維生素和果膠等[4-5]。其生理活性物質(zhì)包括甾醇類(lèi)化合物、萜類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、鞣質(zhì)和多酚等[6-7]。木瓜籽含有脂肪酸、維生素及微量元素等，具有抗氧化、抗腫瘤活性[8-9]。木瓜果實(shí)主要包含黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、三萜類(lèi)、皂苷類(lèi)、糖類(lèi)和鞣質(zhì)等。其中有機(jī)酸類(lèi)主要有咖啡酸、綠原酸和蘋(píng)果酸等。而綠原酸是許多植物中抗菌消炎、清熱解毒的活性成分，具有清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗菌和抗病毒等作用[10]。

木瓜被國(guó)家衛(wèi)生部首批認(rèn)定為藥食同源品種之一，而皺皮木瓜是藥用木瓜的正品[11]。其種子、枝葉及花均可入藥，可作為綠色保健食品或藥品開(kāi)發(fā)。以往對(duì)于木瓜營(yíng)養(yǎng)成分及其提取工藝的研究比較多，而結(jié)合其獨(dú)特的活性成分進(jìn)行分離分析的報(bào)道較少[12-13]。本研究在前期工作中對(duì)木瓜的抑制脂肪酸合酶及抗癌活性進(jìn)行了初步研究，表明木瓜對(duì)脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)具有很高的抑制活性[14]。為進(jìn)一步明確木瓜的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，并對(duì)其中的主要化學(xué)成分進(jìn)行分離分析，研究木瓜中各種有效成分的合理應(yīng)用，對(duì)木瓜中有效成分的含量進(jìn)行測(cè)定，為其作用機(jī)制及藥理作用的后續(xù)研究打好基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)對(duì)木瓜果實(shí)的主要成分及其含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料及方法

1.1 儀器與試劑

采用Agilent 1100 series高效液相色譜儀，Diamonsil C18色譜柱，KQ-500型超聲波清洗器，1000 ml過(guò)濾器，Quattro micro TM API質(zhì)譜儀。

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)，磷酸(分析純，北京世紀(jì)紅星化工有限責(zé)任公司)，木瓜粉末(同仁堂)，二蒸水。

1.2 樣品制備

(1)對(duì)照品配置。精密稱(chēng)取咖啡酸3.2 mg溶于甲醇，定容于10 ml容量瓶，備用。

(2)供試品配置。精密稱(chēng)取木瓜粉末1.0925 g，溶于50 ml甲醇，超聲45 min，補(bǔ)足失去的甲醇，即得儲(chǔ)備液，備用。

1.3 色譜條件

試劑為乙腈、水和磷酸；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.05%磷酸水溶液；梯度洗脫，其程序見(jiàn)表1；流速為0.8 ml/min；進(jìn)樣量為10 ul；檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.4 質(zhì)譜條件

選用電噴霧(ESI)離子源，在負(fù)離子電力模式下采用全掃描的方式，綠原酸的母離子是m/z353.3。質(zhì)譜參數(shù)：脫溶劑氣(N2)流速為350 L/h，錐孔氣(N2)流速為50 L/h，脫溶劑氣溫度為200 ℃，源溫度為120 ℃，錐孔電壓為10V，毛細(xì)管電壓為3.5 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析

在選定的色譜條件下，保留時(shí)間為19.64 min，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖如圖1所示，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜如圖2所示。

圖1 色譜圖

2.2 線(xiàn)性關(guān)系

分別用甲醇稀釋各對(duì)照品儲(chǔ)備液，取綠原酸濃度為(3.2×10-3)～(6.4×10-2)mg/ml，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以相應(yīng)組分峰面積Y對(duì)其進(jìn)樣濃度X (mg/ml)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。得線(xiàn)性方程為：Y=37038X＋18.345(r=0.9993)。在(3.2×10-3)～(6.4×10-2) mg/ml線(xiàn)性關(guān)系良好，檢測(cè)限為(0.4×10-3)mg/ml。

2.3 精密度

取樣品溶液重復(fù)進(jìn)樣，將質(zhì)量濃度為(3.2×10-3) mg/ml的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別測(cè)定5次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)(精密度)為3.1%，表明綠原酸在樣品中較為穩(wěn)定。

2.4 回收率

取木瓜儲(chǔ)備液100 ul，加入50 ul綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.5×10-2)mg/ml，計(jì)算綠原酸回收率為94.1%(測(cè)定5次)。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖

2.5 樣品含量測(cè)定

取木瓜儲(chǔ)備液在同樣色譜條件下進(jìn)行3次測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算含量。測(cè)得木瓜中綠原酸含量為1.3 mg/g，RSD＝0.4%。

3 討論

本研究測(cè)定結(jié)果表明，木瓜中綠原酸含量為1.3 mg/g，RSD＝0.4%；所建立的綠原酸含量測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、回收率高，適用于木瓜的質(zhì)量分析。運(yùn)用本方法測(cè)定木瓜中綠原酸較為穩(wěn)定。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，木瓜對(duì)脂肪酸合酶有較高的抑制活性，而木瓜中含有較多的綠原酸。綠原酸是一種縮酚酸，屬酚類(lèi)化合物，對(duì)抑制突變及抗腫瘤、清除體內(nèi)自由基、抗氧化、保肝利膽以及抗菌抗病毒等有廣泛的生物活性[15]。FAS在癌細(xì)胞組織中高表達(dá)，而木瓜中高含量的綠原酸，可能與其抑制FAS有相關(guān)性，有潛在的抑制腫瘤的作用。

對(duì)于相關(guān)的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)含量測(cè)定方法，不利于制劑的質(zhì)量控制[16]。并且植物藥中的組成復(fù)雜，在不能測(cè)定全部活性成分時(shí)可以測(cè)定其中主要活性成分，作為品種的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)模式。木瓜具有良好的開(kāi)發(fā)前景，通過(guò)國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家的不斷深入研究探索，利用現(xiàn)代的醫(yī)學(xué)分離分析裝備，建立以高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定木瓜中綠原酸含量的方法進(jìn)行研究和質(zhì)量評(píng)價(jià)，將會(huì)發(fā)揮更大的作用。

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Analysis on chlorogenic acid of chaenomeles speciosa and its correlations with anticancer by high performance liquid chromatography-mass spectrometry

ZHAO Guang, LI Jun,DU Xue-jing// China Medical Equipment,2014,11(5):4-6.

Objective:To analyze chlorogenic acid of Chaenomeles speciosa by high performance liquid chromatography-mass spectrometry.Methods:A method for determining chlorogenic acid of Chaenomeles speciosa by HPLC-MS is described. The operating conditions were Diamonsil C18column (5 μm, 4.6×250 mm) at room temperature, acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution as mobile phase by step gradients elution at a flow of 0.8 ml/min and UV detection at 325 nm.Results:The content of chlorogenic acid of Chaenomeles speciosa is 1.3 mg/g (RSD 0.4%), respectively.Conclusion:Chlorogenic acid was detected from Chaenomeles speciosa, which may be related to its inhibition of FAS and the potential role of anticancer.

Chaenomeles speciosa; HPLC-MS; Chlorogenic acid

1672-8270(2014)05-0004-03

R284.1

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.05.002

2013-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(30500648)“以FAS為靶從元寶楓發(fā)展無(wú)耐藥性的抗腫瘤藥物”；北京市自然科學(xué)基金資助(7103168)“以介孔材料為載體從天然產(chǎn)物發(fā)展抗腫瘤靶向給藥系統(tǒng)”；北京市教育委員會(huì)科技發(fā)展計(jì)劃面上項(xiàng)目(KM201010025011)“從虎杖等天然產(chǎn)物中發(fā)展腫瘤化學(xué)預(yù)防藥物”；首都中醫(yī)藥研究專(zhuān)項(xiàng)(ZM02)“醫(yī)院制劑抗瘤丸治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用機(jī)理研究”

①首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院 北京 100069

*通訊作者：lijun88@ccmu.edu.cn

[First-author’s address]School of Chemical Biology and Phamaceutical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China.