李曉紅,梁 媛,謝宇晴,黎 強(qiáng),楊力強(qiáng)△

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530001； 2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所, 北京 100700)

肝郁脾虛證是肝失疏泄、脾失健運(yùn)所致的中醫(yī)證候。近年來很多學(xué)者從腦腸互動角度認(rèn)識肝郁脾虛證的病理機(jī)制，腦腸肽同時分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道，是反映腦腸互動的關(guān)鍵因素。逍遙散始載于《太平惠民和劑局方》，由柴胡、白術(shù)、白芍、生姜、甘草、薄荷、茯苓、當(dāng)歸8味藥物組成，是調(diào)和肝脾的代表方。本實驗通過慢性束縛應(yīng)激[1]方法制作肝郁脾虛證大鼠模型，觀察模型大鼠中樞海馬、杏仁核和外周胃、結(jié)腸組織中腦腸肽SP、VIPmRNA表達(dá)的變化及逍遙散的調(diào)節(jié)作用，為肝郁脾虛證的腦腸互動機(jī)制及逍遙散的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對照組、模型組、逍遙散組,每組各10只。動物每籠5只群養(yǎng)，光照節(jié)律12L∶12D (6∶00～18∶00)，飼養(yǎng)于普通級動物房，室內(nèi)溫度保持為(22±2)℃，相對濕度保持為30%，大鼠喂常規(guī)飼料及飲用水。

1.2 中藥及制備

實驗所用中藥復(fù)方選用《太平惠民和劑局方》中的逍遙散(柴胡30 g，當(dāng)歸30 g，白芍30 g，白術(shù)30 g，茯苓30 g，炙甘草15 g，生姜10 g，薄荷10 g)，中藥飲片購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，用水煎成湯劑，濃縮至含生藥量1.67 g/ml，4℃冰箱保存。

1.3 儀器與試劑

PCR儀為ABI7500 Real-Time PCR System，RNA提取試劑盒Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript III Reverse Transcriptase由Invitrogen公司提供，PCR 試劑盒SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)由Takara公司提供。

1.4 模型制備及藥物干預(yù)

將模型組和逍遙散組大鼠進(jìn)行捆綁束縛造模，隨機(jī)選取束縛時間點，每日3 h, 連續(xù)21 d。正常對照組大鼠不予束縛，自由進(jìn)食、飲水及自主活動。自造模第1天開始，每日在束縛前1 h給各組大鼠灌胃，逍遙散組大鼠灌服逍遙散中藥煎液，根據(jù)成人逍遙散每日用量，按體表面積換算成大鼠用藥量為16.7 g/(kg·d)，灌胃容積為1 ml/100 g體質(zhì)量，正常組、模型組大鼠每日灌服同等換算量的生理鹽水。造模期間根據(jù)大鼠體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

1.5 取材

造模21 d結(jié)束后取材標(biāo)本，各組大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射進(jìn)行深度麻醉(0.4 ml/100 g體質(zhì)量)，將大鼠斷頭，取海馬、杏仁核和胃(胃竇組織距幽門0.5 cm處)、結(jié)腸組織(距肛門7～10 cm處)，胃、結(jié)腸組織用預(yù)冷的生理鹽水沖洗處理，所有標(biāo)本放入液氮速凍后移入-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測

實時熒光定量PCR法檢測海馬、杏仁核、胃、結(jié)腸組織SP、VIP表達(dá)

1.6.1 組織總RNA提取 按照Trizol試劑盒方法提取海馬、杏仁核、胃、結(jié)腸組織總RNA ,把提取的總RNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳，觀察其完整性。NanoDrop 8000分光光度儀測定總RNA的濃度和純度，所有樣品的A260/A280比值均在1.83～2.03范圍之間，滿足實驗要求?？俁NA 于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 PCR引物序列設(shè)計 引物由ABI Primer Express v 2.0軟件設(shè)計，序列由生工生物工程有限公司合成。引物序列如下： SP(forward: 5’ATCGGTGCCAACGATGATCT3’， reverse：5’CCGTTTGCCCATTAATCCAA3’，150 bp)，Vip(forward: 5’CCAGAAGGAAAGACCCAAGGA3’ reverse：5’CCTGTCATCCAACCTCACTGAA3’，150 bp)，GAPDH(forward: 5’AGGAGTCCCCATCCCAACTC3’， reverse：5’TTTTGAGGGTGCAGCGAACT3’， 140 bp)。

1.6.3 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 采用20 μL反應(yīng)體系，取總RNA5μg，加入Random primer 1 μl，dNTP (10 mM) 1 μl，加入ddH2O使總體積達(dá)到13 μl，混合后65℃加熱5 min，立即冰浴1～2 min；加入5×First strand buffer 4 μl，0.1 M DTT 1 μl，RNaseOUT 1 μl，SuperScript III RT 1 μl，充分混勻，25℃孵育5 min；50℃孵育60 min；70℃加熱15 min，以滅活SuperScript III RT。

1.6.4 實時- 熒光定量PCR反應(yīng) 按照SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)試劑盒操作說明進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，通過收集熒光強(qiáng)度信號的變化來檢測循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)，由ABI7500 Real-Time PCR System監(jiān)測。20 μl反應(yīng)體系組成為SYBR Premix Ex Taq II(2X) 10 μl、引物各0.8 μl、ROX reference dye II (50 X) 0.4 μl、 cDNA模板0.25 μl、加入ddH2O補(bǔ)足至總體積20 μl。反應(yīng)條件：第1步：預(yù)變性95℃ 1min；第2步：變性95℃ 10 s， 60℃ 32 s，40個循環(huán)；第3步：溶解曲線，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，終止反應(yīng)，降溫至 4℃。SP、VIP mRNA的表達(dá)用2-△△Ct計算其相對表達(dá)量[2]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬、杏仁核、胃、結(jié)腸組織SPmRNA表達(dá)的變化

表1顯示，與正常對照組比較模型組大鼠海馬、結(jié)腸組織SPmRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)，杏仁核、胃組織SPmRNA表達(dá)無明顯變化；與模型組比較逍遙散組大鼠海馬、結(jié)腸組織SPmRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，杏仁核SPmRNA表達(dá)略降低(P>0.05)，胃組織SPmRNA表達(dá)無明顯變化。

表1 各組大鼠海馬、杏仁核、胃、結(jié)腸組織SPmRNA表達(dá)的變化

注：與正常組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01

2.2 各組大鼠海馬、杏仁核、胃、結(jié)腸組織VIPmRNA表達(dá)的變化

表2顯示，與正常對照組比較模型組大鼠海馬VIPmRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)，杏仁核、胃組織VIPmRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01或P<0.05)，結(jié)腸組織VIPmRNA表達(dá)有下降趨勢(P>0.05)；與模型組比較，逍遙散組大鼠海馬VIPmRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，杏仁核、胃組織VIPmRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01或P<0.05)，結(jié)腸組織VIPmRNA表達(dá)升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠海馬、杏仁核、胃、結(jié)腸組織VIPmRNA表達(dá)的變化

注：與正常組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01

3 討論

腦腸肽不僅存在于胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞、腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)，也存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，腦腸肽可通過體液途徑或作為腸道神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)在外周對胃腸運(yùn)動功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，還可通過影響迷走神經(jīng)環(huán)路在中樞水平發(fā)揮作用[3]，對胃腸功能、人類情感、行為等產(chǎn)生影響[4]，是認(rèn)知和情感中樞與神經(jīng)內(nèi)分泌、腸神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相聯(lián)系的雙向交通通路的分子基礎(chǔ)[5]。腦腸肽的增多和減少可引起胃腸道、免疫、神經(jīng)功能失調(diào)而致疾病發(fā)生。SP、VIP是兩種重要的腦腸肽，在探尋胃腸動力變化的物質(zhì)基礎(chǔ)中研究較多[6,7]。

SP為速激肽家族中含11個氨基酸殘基的多肽,在全身均有分布,以胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)濃度最高。SP在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)均為興奮性神經(jīng)遞質(zhì),一般認(rèn)為SP是一種傳遞傷害性信息的神經(jīng)肽。在ENS中, SP可增加胃腸蠕動,有強(qiáng)烈促消化道平滑肌收縮、加強(qiáng)結(jié)腸的集團(tuán)推進(jìn)運(yùn)動、刺激小腸、結(jié)腸黏膜分泌水和電解質(zhì)作用[8]，還可刺激內(nèi)臟血管擴(kuò)張并介導(dǎo)內(nèi)臟疼痛[9], 發(fā)揮使肥大細(xì)胞釋放組胺、漿液外滲、影響巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞等外周生理調(diào)節(jié)作用[10]，是一種主要的促炎癥性感覺性神經(jīng)肽[11]。腦內(nèi)SP參與感覺、運(yùn)動和情緒等調(diào)節(jié)，并與焦慮癥、抑郁癥等精神疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)[12]。SP能引起正常人產(chǎn)生與抑郁癥病人相似的情緒，導(dǎo)致睡眠和神經(jīng)內(nèi)分泌的改變，臨床上重癥抑郁癥病人血漿SP的循環(huán)水平升高，抗抑郁劑治療使之含量達(dá)到正常[13]。

VIP是一種含28個氨基酸殘基的堿基多肽, 屬于促胰液素-胰高血糖素家族，因其有明顯的擴(kuò)張血管作用而被命名為血管活性腸肽。VIP作為胃腸動力抑制性神經(jīng)元,可引起胃容受性舒張，能抑制胃酸分泌， 松弛胃腸道平滑肌， 抑制結(jié)腸和直腸的緊張性。在中樞中，VIP與引起覺醒效應(yīng)、提高體溫、攝食睡眠有關(guān)。近年來的研究表明，VIP可刺激垂體細(xì)胞分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)而起到類似促皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)的作用,參與ACTH分泌的調(diào)節(jié)[14]。而Barazmji 等人發(fā)現(xiàn),將ACTH注入側(cè)腦室對饑餓大鼠或自由攝食鼠能起到抑制食欲的作用[15]。VIP還能抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，同時提高機(jī)體抗炎因子水平，維持促炎-抗炎因子水平[16]。

本次研究顯示，模型組大鼠SP、VIPmRNA表達(dá)在中樞和外周出現(xiàn)了異常分布，SP在海馬和結(jié)腸組織顯著升高，VIP在海馬顯著升高、杏仁核和胃組織顯著降低。實驗過程中觀察到，模型組大鼠出現(xiàn)情志抑郁、焦慮、飲食減少、體質(zhì)量減輕、倦怠乏力、排便次數(shù)增加及大便稀軟等癥狀表現(xiàn)，可能與海馬SP、VIP和結(jié)腸組織SP的表達(dá)升高有關(guān)。 VIP在胃組織顯著降低，一方面可能由于促進(jìn)了促炎細(xì)胞因子的釋放和增強(qiáng)了胃黏膜血管的收縮，從而使我們在實驗過程中不僅肉眼觀察到模型組大鼠胃部黏膜出現(xiàn)瘀血、水腫，光學(xué)顯微鏡下胃部黏膜中也見到大量的炎癥細(xì)胞滲出[17]；另一方面可能導(dǎo)致對胃的抑制作用減弱或消失,使胃出現(xiàn)過度的蠕動，胃的緊縮甚至痙攣則使有效的推動性運(yùn)動減弱，也可能是加重肝郁脾虛證大鼠食欲下降的原因。上述實驗結(jié)果還顯示，逍遙散能降低海馬、結(jié)腸組織SP表達(dá)及海馬VIP表達(dá)，升高杏仁核和胃組織VIP表達(dá)，表明逍遙散對中樞和外周SP、VIP的變化都有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，課題組認(rèn)為臨床上肝郁脾虛證病人表現(xiàn)出精神情志異常，以及出現(xiàn)納呆、噯氣、脘腹痛、腹脹、腹瀉等消化不良癥狀，可能與中樞和外周SP和VIP的變化有關(guān)，SP、VIP可能參與了肝郁脾虛證腦腸互動機(jī)制，但僅僅SP、VIP的變化是不能完全解釋肝郁脾虛證患者的臨床表現(xiàn)的，必定有眾多的腦腸肽參與肝郁脾虛證這一病理演變過程。近年來，系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)證候的研究中已得到廣泛的應(yīng)用[18]，今后計劃借鑒系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)平臺對肝郁脾虛證及逍遙散進(jìn)行深入研究，將有利于從整體上闡明肝郁脾虛證的腦腸互動機(jī)制及逍遙散治療肝郁脾虛證的作用機(jī)制。

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