李白雪，馮全生△，張傳濤，吳 疆，范昕建

(1．成都中醫(yī)藥大學(xué),成都 610075；2．成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,成都 610071)

氧化應(yīng)激在肝細(xì)胞損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，抗氧化治療對(duì)防治肝臟疾病有著重要的意義。核因子相關(guān)因子2(Nrf2)是一種氧化應(yīng)激基本表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element，ARE)結(jié)合，調(diào)控下游Ⅱ相代謝酶基因的轉(zhuǎn)錄活性，包括醌氧化還原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，Nqo1)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)以及谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase,Gcl)，Gcl是谷胱甘肽(glutathione,GSH)合成的限速酶，其本身是由催化亞基(Gclc)和調(diào)節(jié)亞基(Gclm)2個(gè)亞單位構(gòu)成，這一系列保護(hù)性蛋白能夠保護(hù)機(jī)體免受活性物質(zhì)(ROS)及一些毒性物質(zhì)(致癌物、藥物代謝活化產(chǎn)物)的侵害，同時(shí)在抗炎癥[1]、抗應(yīng)激[2]、抗凋亡[3]以及神經(jīng)保護(hù)[4]等方面具有廣泛的細(xì)胞保護(hù)功能。Nrf2-ARE也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的抵抗各種外環(huán)境應(yīng)激和內(nèi)源性應(yīng)激的通路。

胡黃連是傳統(tǒng)中藥，來(lái)源于玄參科植物黃連或西藏胡黃連的根莖，具有清濕熱、除骨蒸、消疳熱、利肝膽的作用，用于濕熱瀉痢、黃疸、痔疾、骨蒸潮熱、小兒疳熱等[5]?，F(xiàn)代中藥藥理表明，西藏胡黃連的主要含有環(huán)烯醚萜苷類(lèi)、葫蘆素類(lèi)、酚甙類(lèi)三大類(lèi)成分及少量的芳香酸和D-甘露醇，其中胡黃連環(huán)烯醚萜苷主要活性成分為胡黃連苷Ⅰ～Ⅲ(PicrosideⅠ～Ⅲ)，具有明顯保肝作用。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，胡黃連苷Ⅱ具有明顯的保肝作用，且與其抗氧化作用有關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)胡黃連苷Ⅱ作用于人肝細(xì)胞細(xì)胞株(L-02)，檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)抗氧化通路Nrf2-ARE及下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶mRNA的變化，觀察胡黃連苷Ⅱ的保肝作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY，美國(guó))，小牛血清(蘭州民海生物有限公司)，噻唑藍(lán)(MTT，sigma公司，美國(guó)),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，RNA提取試劑盒( RNAiso plus，大連TaKaRa公司)，SYBR染料法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，大連TaKaRa公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，Nrf2、Gclc、Gclm、Nqo1、GST和GAPDH引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。倒置顯微鏡(CKX-31 Olympus，日本)，酶標(biāo)儀(Bio-rad 550，美國(guó))，PCR儀(Bio-rad iCycler，美國(guó))，熒光定量 PCR儀(Bio-rad IQ5，美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞株由四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保種、傳代，細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱。

1.3 藥物制備

胡黃連苷Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品 (picroside Ⅱ,批號(hào)111596-200402)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；胡黃連苷Ⅱ用無(wú)血清培養(yǎng)液(DMEM)溶解，配制成5 mmol/L濃度的含藥培養(yǎng)液。

1.4 分組、造模及藥物處理[7]

將成對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期的L-02細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，接種密度為1×104個(gè)/孔，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，依據(jù)前期研究分別選用胡黃連苷Ⅱ(0、0.5、5 mmol/L)預(yù)處理3 h后[6]同時(shí)設(shè)對(duì)照組，除對(duì)照組外各組加入0.6 mmol/LH2O2作用1 h造成氧化損傷模型處理，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.5 主要方法

1.5.1 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞處理好之后，吸去含有藥物的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含1 mg/mlMTT的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h進(jìn)行顯色反應(yīng)，然后吸去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩混勻后，用BIO-RAD550型酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的光密度值(OD)，并依據(jù)OD值按公式計(jì)算細(xì)胞存活率：實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%(各組OD值均已減去空白調(diào)零孔OD值)。

1.5.2 ALT和AST檢測(cè) 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按ALT、AST測(cè)試盒(賴(lài)氏法)說(shuō)明操作，以測(cè)定吸光度值，并查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相應(yīng)的AST/ALT單位。

1.5.3 qRT-PCR檢測(cè) 通過(guò)RNAiso plus提取細(xì)胞總RNA，利用EasyScript試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為25℃10 min、42℃30 min、75℃5 min。熒光定量PCR引物為： Nrf2 sense：5’- ACAATGAGGTTTCTTCGGCTAC-3’，anti-sense：5’- CGTCTAAATCAACAGGGGCTAC-3’；Gclc sense：5’-ATGGAGGTGCAATTAACAGAC-3’，anti-sense：5’-CTGCATTGCCACCTTTGCA-3’；Gclm sense：5’-GCTGTATCAGTGGGCACAG-3’， Anti-sense：5’-CGCTTGAATGTCAGGAATGC-3’；Nqo1 sense：5’-GGTTTGAGCGAGTGTTCATAGG-3’，anti-sense：5’-GCAGAGAGTACATGGAGCCAC-3’；GSTa4 Sense：5’-GAGAACCCTGATTGACATGTA-3’，Anti-sense：5’-GCTGATTACCAACAAGAAAGC-3’；GAPDH sense：5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3’，anti-sense：5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3’；熒光定量PCR反應(yīng)體系(10 μL)為2×TaqPCR Master Mix 5 μL，上下引物(10 μmol/L)各0.25 μL，cDNA1 μL，雙蒸水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)條件為94℃5 min、94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)Gene Expression Divisio Outline軟件計(jì)算目的基因熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果(Ct值)的相對(duì)表達(dá)量(以對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量=1)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胡黃連苷Ⅱ?qū)2O2損傷L-02肝細(xì)胞MTT OD值的影響

表1 胡黃連苷Ⅱ?qū)2O2損傷L-02肝細(xì)胞MTT OD值的影響

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01；與0.5 mMpicⅡ+H2O2組比較：△P<0.05,△△P<0.01；與5 mMpicⅡ+H2O2組比較：□P<0.05,□□P<0.01

2.2 胡黃連苷Ⅱ?qū)2O2誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷ALT和AST酶活性的影響

表2 胡黃連苷Ⅱ?qū)2O2誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷的ALT和AST活性影響

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01；與0.5 mM picⅡ+0.6 mM H202組比較：△P<0.05，△△P<0.01； 與5 mMpicⅡ+H2O2組比較：□P<0.05,□□P<0.01

2.3 胡黃連苷Ⅱ干預(yù)對(duì)Nrf2及下游靶基因NQO1、Gclm、Gclc和GST mRNA表達(dá)水平的影響

圖1、2顯示，Real Time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，胡黃連苷Ⅱ處理后，Nrf2及下游基因Gclc、Gclm、NQO1和GST表達(dá)顯著變化，均較模型組均增高(P<0.05)。同時(shí)胡黃連苷Ⅱ 高濃度處理組Gclm、NQO1和GSTmRNA表達(dá)較對(duì)照組增高(P<0.05)，并隨濃度升高呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明胡黃連苷Ⅱ?qū)τ贜rf2及下游抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶mRNA水平有上調(diào)作用。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)Gene Expression Divisio Outline軟件計(jì)算目的基因熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果(Ct值)的相對(duì)表達(dá)量(以對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量=1)。

圖1 胡黃連苷Ⅱ?qū)2O2誘導(dǎo)氧化損傷肝細(xì)胞(L-02)Nrf2 mRNA表達(dá)的影響注：與模型組比較：* P<0.05,** P<0.01；與對(duì)照組比較：△P<0.05,△△ P<0.01；與0.5 mM pic+0.6 mM H2O2比較：□P<0.05, □□P<0.01；與5 mM pic+0.6 mM H202比較：#P<0.05, ##P<0.01

圖2 胡黃連苷Ⅱ?qū)2O2誘導(dǎo)氧化損傷肝細(xì)胞L-02的Gclc、Gclm、NQO1、GSTmRNA表達(dá)影響

圖3 Nrf2、Gclc、Gclm、NQO1、GST基因溶解曲線圖

3 討論

在肝細(xì)胞損傷過(guò)程中，氧自由基引起的氧化損傷，再加上炎癥反應(yīng)起重要作用。氧化應(yīng)激不僅是肝功能障礙的一部分，也是所有肝損傷的病理生理基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷，H2O2可誘導(dǎo)L-02細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡并可在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生(OH·)，肝細(xì)胞在氧化應(yīng)激作用下，細(xì)胞模型結(jié)構(gòu)包括線粒體膜受到破壞，膜通透性增加，造成鈣超載[8]，肝細(xì)胞內(nèi)ALT與AST釋放增加。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，核因子 NF-E2 相關(guān)因子 ( nuclear fac-tor erythroid 2-related factor 2，Nrf2) 是 ARE 的激活因子。靜息狀態(tài)下，Nrf2與其胞漿抑制蛋白Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-likeECH-associatedp-rotein1，Keap1)相結(jié)合，被泛素蛋白酶體途徑迅速降解，從而處于相對(duì)抑制狀態(tài)，當(dāng)受到親電試劑或 ROS的刺激時(shí)，Nrf2從Keap1中解離，然后穩(wěn)定狀態(tài)的Nrf2轉(zhuǎn)移入核，與ARE的啟動(dòng)子序列結(jié)合，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相代謝酶的表達(dá)，增強(qiáng)肝細(xì)胞的解毒及抗氧化能力[9]，對(duì)維持肝臟功能的穩(wěn)定以及阻止肝臟疾病的發(fā)生有重要的作用。Nrf2調(diào)控的代表性下游基因NQO1、GST和Gclc等，都是對(duì)抗應(yīng)激反應(yīng)和抗氧化損傷的重要組成部分[10]。

實(shí)驗(yàn)表明，H2O2損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化損傷，肝細(xì)胞膜及線粒體膜破壞，通透性增高，以致細(xì)胞存活率下降，同時(shí)培養(yǎng)上清液中ALT、AST水平明顯升高，而經(jīng)胡黃連苷Ⅱ預(yù)處理各組細(xì)胞存活率增高，ALT、AST水平也較模型組明顯降低，提示肝細(xì)胞損傷程度較模型組輕，同時(shí)Nrf2及其下游Gclc、Gclm、NQO1和GST基因的mRNA表達(dá)較模型組升高，并隨藥物濃度升高呈上升趨勢(shì)，提示細(xì)胞抗氧化能力增強(qiáng)，而Nrf2模型組與對(duì)照組差異較小，考慮存在僅為Nrf2核轉(zhuǎn)位增加，而細(xì)胞內(nèi)總Nrf2含量不變，需檢測(cè)Nrf2胞漿胞核分布情況進(jìn)一步闡明機(jī)制。通過(guò)激活Nrf2/ARE通路抵抗H2O2所致的L-02肝細(xì)胞氧化損傷，可能是胡黃連苷Ⅱ發(fā)揮抗氧化保肝作用的重要機(jī)制之一，同時(shí)為臨床該藥物的合理應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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