吳秋玲,劉竺華,李朝喧,周曉麗

(1．山西中醫(yī)學(xué)院，太原 030024； 2.山西省中醫(yī)院，太原 030001)

長(zhǎng)期以來(lái),腫瘤一直是危害人類(lèi)健康的重要?dú)⑹?，而其中大多?shù)患者均死于腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。臨床上如何防止腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，是腫瘤防治的重要環(huán)節(jié)?！澳[瘤生長(zhǎng)依賴(lài)血管生成”假說(shuō)的提出，使抗血管生成的研究得到廣泛關(guān)注，目前國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者把研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到從中藥中篩選抑制腫瘤新生血管的藥物。藤梨根為獼猴桃科獼猴桃，屬軟棗獼猴桃的根，性酸、澀、涼，具有清熱解毒、消腫疥、祛風(fēng)除濕、利尿止血的功效，臨床廣泛用于抗腫瘤治療，常與野葡萄藤、半枝蓮、半邊蓮、白茅根等配伍使用于各種癌癥,尤對(duì)消化道腫瘤胃癌、腸癌等療效顯著。

本實(shí)驗(yàn)采用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)技術(shù)和計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)，觀察中藥藤梨根含藥血清對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響，以衡量中藥藤梨根抑制或誘生新血管生成的能力，探討藤梨根抗腫瘤的作用機(jī)制，為臨床中藥治療腫瘤并防止腫瘤轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新鮮白皮種蛋，表面清潔,每枚重50 g～60 g， 蛋殼均質(zhì)，受精率>95%，購(gòu)自山西農(nóng)科院養(yǎng)殖場(chǎng)。8周齡Wistar大鼠12只，雌雄各半，體質(zhì)量(190±20) g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 電熱恒溫孵育箱，DHP-9162上海-恒科技有限公司；超凈工作臺(tái)， 上海巴艾貝斯；倒置熒光顯微鏡圖像采集處理系統(tǒng)；醫(yī)用圖像分析儀，Image-Pro，美國(guó)；解剖顯微鏡，德國(guó)Leica公司；眼科剪、眼科鑷，上海醫(yī)療器械公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)藥品 藤梨根由山西省中醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)專(zhuān)家鑒定質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備 (1)藤梨根濃縮液的制備：取藤梨根120 g，按常規(guī)中草藥煎煮方法，煎煮提取濃縮至60 ml，得含相當(dāng)于藤梨根生藥2 g/ml的濃縮液，冷卻保存?zhèn)溆茫?2)動(dòng)物選擇與分組：清潔級(jí)Wistar大鼠12只，雌雄各半，隨機(jī)數(shù)字表法分為高劑量組、低劑量組、血清組(陰性對(duì)照組)，每組4只；(3)給藥方法：藤梨根制成水煎濃縮液，劑量參考李振光報(bào)道的給藥劑量[1]。高劑量為臨床成人(體質(zhì)量60 kg)劑量的20倍，低劑量為臨床成人(體質(zhì)量60 kg)劑量的10倍，換算得出大鼠每100 g體質(zhì)量每天給藤梨根高劑量為3.125 ml藤梨根濃縮液(即6.25 g)，低劑量組減半。血清組給予每天2 ml生理鹽水。大鼠每天2次灌胃給藥,連續(xù)給藥1周；(4)含藥血清的制備：第7天于灌胃給藥2 h后，以10%水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈取血5 ml離心，吸取透明上清液，分離血清、滅活、除菌,試管分裝，-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CAM模型的制備 (1)種蛋表面依次以溫水(30～38 ℃)和1∶1000新潔爾滅液溶液消毒后開(kāi)始孵育。種蛋孵育于有通氣孔且溫度設(shè)置為38.4 ℃的培養(yǎng)箱中(濕度在65～75%)，4 d后溫度設(shè)置為38.2 ℃。每天轉(zhuǎn)蛋4～5次，并檢查胚胎發(fā)育情況，及時(shí)淘汰發(fā)育不良的種蛋；(2)于第2～10天在照卵燈指示下尋找胚頭，確定雞胚絨毛尿囊膜位置。酒精消毒開(kāi)窗位置，用牙科鉆在氣室頂端打1 mm～2 mm小孔并穿透氣室殼膜，在距胚頭前0.5 cm，兩條卵黃靜脈之間的卵殼投影部位用筆標(biāo)記出面積2 cm×1.5 cm區(qū)域,用牙科鉆在表面輕輕磨切出凹痕,無(wú)菌生理鹽水消毒，用眼科鑷平行向上輕揭凹陷處蛋皮，輕撕內(nèi)殼膜暴露CAM，制成假氣室。以滅菌透明膠膜封閉假氣室，形成透明觀察窗。解剖顯微鏡下觀察并原位攝影。

1.2.3 藤梨根對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的影響 (1)于孵育第6天，在檢卵燈下觀測(cè)并標(biāo)記氣室及雞胚位置，同上述方法制成假氣室。顯微鏡下觀察并記錄；(2)給藥方法:制備假氣室之后，用眼科鑷將無(wú)菌明膠海綿小塊(3 mm×3 mm×3 mm)置于藤梨根含藥血清中，充分飽和后，放置于距離胚頭0.5 cm處兩條卵黃靜脈之間的相對(duì)少血管區(qū)，無(wú)菌透明膠膜封貼，38.2 ℃孵育48 h；(3)觀察方法:孵育48 h后剝離假氣室周?chē)牡皻ぃ鼓蚰夷こ浞直┞?，解剖顯微鏡下記錄血管圖像；(4)檢測(cè)指標(biāo):將錄制好的圖像調(diào)入圖像分析軟件，參考文獻(xiàn)計(jì)數(shù)方法，以明膠海綿為中心選取相同面積的4個(gè)區(qū)域，應(yīng)用醫(yī)用圖像處理軟件測(cè)出所選區(qū)域的血管數(shù)量和血管面積。

2 結(jié)果

2.1 藤梨根高低劑量組對(duì)CAM血管生成數(shù)量的影響

表1顯示,我們之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，4至6 d雞胚對(duì)于研究觀察血管生成情況最理想，但4～5 d的雞胚生命力弱、死亡率較高。 6 d雞胚血管網(wǎng)初步形成，可觀察到數(shù)量較多的小血管及分支，較適宜觀察藥物對(duì)血管生成影響的研究，因此選擇6 d雞胚進(jìn)行觀察研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藤梨根高劑量組與空白組、血清組相比較，有較明顯的抑制新血管生成能力，藤梨根低劑量組與空白組比較有一定的抑制作用但不顯著(P<0.01)。

2.2 藤梨根高低劑量組對(duì)CAM血管面積影響

表1顯示，藤梨根高低劑量組具有一定抑制血管生成面積的作用，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清組和空白組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

惡性腫瘤被古代醫(yī)家歸屬于為積聚、石瘕、癥瘕等范疇。《諸病源候論》指出:“積聚者由于陰陽(yáng)不和，臟腑虛弱，受之于風(fēng)邪，搏于臟腑之氣所謂也?！?《中藏經(jīng)》中指出，癌瘤等“之所作也，皆五臟六腑蓄毒不流則生矣，非獨(dú)因榮衛(wèi)壅塞而發(fā)者也”。認(rèn)為臟腑“蓄毒不流”是這類(lèi)難治性疾病的病機(jī)本質(zhì)，而瘀血留于局部，即惡血，日久可腐變或潰爛成毒，故又有“瘀毒”之說(shuō)。《圣濟(jì)總錄》中有“毒熱內(nèi)壅，則變?yōu)轲鲅钡恼f(shuō)法。清代醫(yī)家王清任進(jìn)一步分析：“蘊(yùn)毒在內(nèi)，燒煉其血，血受煉燒，其血必凝”，遂成毒瘀?！度数S直指附遺方》指出：“癌者，上高下深，巖穴之狀，顆粒累垂，毒根深藏?！蓖瑯犹岢隽恕岸靖畈亍笔前┝鲭y治的關(guān)鍵。有學(xué)者認(rèn)為這“深藏”的毒根，就是存在于腫瘤內(nèi)生長(zhǎng)迅速的功能性血管，而這些血管供應(yīng)著豐富的血液，促使腫瘤快速增殖。故目前許多專(zhuān)家認(rèn)為，腫瘤治療當(dāng)采用清熱解毒、活血化瘀等方法。藤梨根具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕的功效，臨床廣泛用于抗腫瘤治療，尤對(duì)消化道腫瘤如胃癌、腸癌等療效顯著。在前期小鼠體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，藤梨根作用后瘤體縮小，顯微鏡下觀察瘤體內(nèi)血管減少，由此推測(cè)抑制血管生成可能是其抗腫瘤的機(jī)制之一，因此我們通過(guò)觀察藤梨根對(duì)CAM血管形成的影響，進(jìn)一步探討藤梨根抑制腫瘤的機(jī)理。

表1 藤梨根含藥血清對(duì)CAM血管生成的影響

注：與空白組比較:*P<0.05，**P<0.01，與血清組比較:△P<0.05，△△P<0.01，用藥組等劑量比較：▲▲P<0.01

血管生成模型的建立是腫瘤抗血管生成研究必須的關(guān)鍵性步驟。自Folkman[2]提出抗血管生成理論至今,對(duì)腫瘤血管形成的機(jī)制和抗血管生成藥物篩選等方面的研究已取得較大進(jìn)展。大量的血管生成模型已建立,體外模型如內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和小管形成以及組織模型；體內(nèi)模型如動(dòng)物角膜或虹膜內(nèi)腫瘤移植模型、皮下氣囊模型、顱窗軟腦膜血管模型、兔耳廓和皮膚內(nèi)移植模型等。雞胚絨毛尿囊膜模型相比其他模型具有一定的優(yōu)勢(shì),如雞胚發(fā)育初期血管與腫瘤細(xì)胞的新生血管相似, 均表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞胞漿少，線粒體豐富，毛細(xì)血管缺少外周細(xì)胞；而且作為一種天然的免疫缺陷宿主，雞胚可接受癌細(xì)胞接種和組織的移植；CAM技術(shù)較簡(jiǎn)便，能耐受一定范圍的溫度變化，且價(jià)格低廉,故被廣泛采用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中藥藤梨根臨床抗腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，值得在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入研究，如對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況和VEGF的表達(dá)情況等進(jìn)行研究，揭示中藥抗腫瘤的機(jī)理，為臨床治療腫瘤尋找副作用小的高效中藥。

[1] 李振光,王凈凈.關(guān)于中藥血清藥理學(xué)方法的思考[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2002,9(2):5.

[2] Folkman J.Tumor angiogenesis, therapeutic implications[J]. N Engl J Med,1971,285(21):1182-1186.