吳 丹, 劉 英, 陳健初

(1. 浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 310058；2. 杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測中心, 浙江 杭州 311100)

0 引 言

柚子(Citrusgrandis(L. ) Osbeck) 是蕓香科柑桔屬植物，盛產(chǎn)于我國東南及南方，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位。四季柚為柚子的優(yōu)良品系之一，具有滋陰、清熱、開胃、消食、解酒、降壓降脂、清肺等功效[1-3]。柚果實中不僅含有多種人體必需營養(yǎng)元素，還含有一些非營養(yǎng)性生理活性成分，如黃烷酮糖苷類化合物，包括柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等，這些成分具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗微生物、抑酶、降血糖、降血壓、預(yù)防動脈粥樣硬化等活性[4-8]。

本文建立了一種高效液相色譜法(HPLC)，該方法可同時測定四季柚果汁中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3種黃烷酮糖苷類化合物含量。3種黃烷酮糖苷類化合物的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

一般黃烷酮檢測方法包括光譜法[9-10]、色譜法[11-13]、毛細管電泳法[14]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]等，以HPLC最為常用，通常通過梯度洗脫方式獲得理想的圖譜數(shù)據(jù)。本文通過等梯度洗脫HPLC法同時測定3種黃烷酮糖苷類化合物，簡便快捷、靈敏度高、重新性好，為四季柚的黃酮類物質(zhì)檢測提供技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Waters2696-2996，PDA測器)；SOCOREX系列移液槍；Mettler Toledo GB204 萬分之一分析天平(上海天平儀器廠)；DKS-24型 電熱恒溫水浴鍋(杭州藍天化驗儀器廠)；DFT-200手提式高速中藥粉碎機(溫嶺市大德中藥機械有限公司)；YP1200電子天平(上海第二天平儀器廠)；離心機(Eppedorf)；SHZⅢ型循環(huán)水多用真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

標準品：橙皮苷(純度≥98%)，柚皮苷(純度95%)，新橙皮苷(純度90%)，購于Sigma公司。

試劑：乙酸(AR)，甲醇(HPLC級和AR)，乙醇(AR)購于杭州雙林化工試劑廠，娃哈哈純凈水購于超市。

1.2 標準溶液配制

準確稱取柚皮苷9.0 mg ，新橙皮苷7.8 mg, 橙皮苷4.4 mg，用色譜級甲醇溶解，并完全轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中用甲醇定容制成混標工作液。

1.3 色譜條件

色譜柱：安捷倫C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) ；流動相：水∶甲醇∶乙酸=56∶40∶4；檢測波長283 nm；流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

1.4 樣品處理

四季柚樣品取之浙江蒼南縣，一份為未成熟樣品，9月底份采摘；另一份為成熟樣品11月底采摘。采下后將果皮和果肉剝離，果肉部分置于四層紗布中手工擠汁得到四季柚果汁，果汁取15 mL于50 mL三角瓶中，加入15 mL甲醇超聲20 min，將汁液轉(zhuǎn)入離心管，4 000轉(zhuǎn)離心10 min, 取上清液備用。

1.5 高效液相色譜測定

將配制好的標準溶液和處理好的樣品溶液按照色譜條件進樣并進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

取混標工作液稀釋到適當(dāng)濃度進行HPLC分析。研究表明,當(dāng)流速為1.0 mL/min時，3種黃烷酮標準品的分離效果最好，在10 min內(nèi)得到良好的分離圖譜，3種黃烷酮化合物的保留時間分別為：柚皮苷7.92 min，橙皮苷8.71 min，新橙皮苷9.59 min(見圖2)。

圖2 混標HPLC譜圖(依次為柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷)

2.2 線性范圍和檢出限

分別取混標工作液0，2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0 mL于6只10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，得到系列濃度，每一濃度分別平行測定3次，以平均峰面積y為縱坐標，質(zhì)量濃度x為橫坐標作圖，擬合線性回歸方程,見表1。柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷的線性回歸方程R2>0.999 3，顯示了較好的線性關(guān)系。

表1 3種黃烷酮標準曲線的線性范圍及回歸方程

2.3 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性

取混合對照工作液稀釋5倍，連續(xù)測定6次，計算得到3種黃烷酮的峰面積的相對標準偏差(RSD)均不高于2.5%，表明儀器精密度良好。取5倍稀釋混合標準液，在室溫下放置1、2、3、4、5 h后進樣分析，得到3種黃烷酮物質(zhì)的峰面積的RSD均不高于4.5%，表明該方法穩(wěn)定性良好，待測溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。取5倍稀釋混合標準液6份，在上述色譜條件下測定，結(jié)果柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷的平均含量分別為35.20，30.16，18.00 μg/mL，RSD分別為2.22%，3.33%，2.27%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 加標回收率

準確稱取已知含量的樣品6份，分別按照相當(dāng)于樣品中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的80%，100%，120%的量加入各對照品，制備待測樣品溶液，按色譜條件測定，計算得加樣回收率為95%～103%。

2.5 樣品測定

取處理后的成熟和未成熟的四季柚果汁樣品各3份，按照色譜條件進行測定，根據(jù)回歸方程計算含量，結(jié)果見表2。可以看到，四季柚果汁中3種黃烷酮類化合物的含量隨成熟度有所不同，未成熟的四季柚果汁中以柚皮苷含量最高，其次為橙皮苷，新橙皮苷含量最低；而成熟果汁中以橙皮苷含量最高，柚皮苷含量有明顯下降，而新橙皮苷沒有檢出。

表2 未成熟與成熟時期四季柚果汁中主要黃烷酮成分的含量

3 結(jié) 語

本文建立了同時測定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的HPLC法。經(jīng)驗證，該方法簡便，表現(xiàn)出良好的線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和準確度?？捎糜谒募捐旨捌渌肿庸蛘吖ぶ械南嚓P(guān)黃烷酮類物質(zhì)含量的測定。

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