高 強(qiáng)，許保銀，程逸冰，王 林，張朝正，田萍萍

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué)與信息工程學(xué)院，天津 300222)

運(yùn)用綠色熒光蛋白探討肉葡萄球菌雙精氨酸分泌途徑

高 強(qiáng)1，許保銀1，程逸冰1，王 林2，張朝正1，田萍萍1

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué)與信息工程學(xué)院，天津 300222)

根據(jù)肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)TM300的基因組序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到其tufA基因的啟動(dòng)子Peftu片段與大腸桿菌–葡萄球菌穿梭載體pBT2-Tat-GFP連接，構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pBT2-ETG．結(jié)果表明，穿梭質(zhì)粒pBT2-ETG成功地轉(zhuǎn)入大腸桿菌與肉葡萄球菌宿主中穩(wěn)定表達(dá)具有活性的綠色熒光蛋白GFP，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到肉葡萄球菌宿主的細(xì)胞壁，為進(jìn)一步研究肉葡萄球菌雙精氨酸(Tat)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)正確分泌其他外源蛋白奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)．

肉葡萄球菌；綠色熒光蛋白(GFP)；雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑；啟動(dòng)子Peftu；Tat信號(hào)肽

作為肉制品發(fā)酵行業(yè)中形成肉制品風(fēng)味的關(guān)鍵菌種，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)在歐洲等地被用作發(fā)酵肉產(chǎn)品起始培養(yǎng)物已經(jīng)超過(guò)60年[1].與其他葡萄球菌相比，它不產(chǎn)生任何毒素、溶血素、凝固酶或聚集因子，是葡萄球菌屬中被完全確認(rèn)的食品級(jí)GRAS(generally regarded as safe)菌株[2]．肉葡萄球菌具有很低的胞外蛋白水解能力，所以該菌可以作為基因克隆宿主菌[3]用于分子遺傳學(xué)方面進(jìn)行葡萄球菌屬相關(guān)代謝途徑的研究，以及安全正常地表達(dá)和分泌異源蛋白．

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白，1962年由Shimomura等[4]在多管水母中首次發(fā)現(xiàn)．GFP受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)可發(fā)射出綠色熒光，發(fā)色團(tuán)是自身分子內(nèi)由3個(gè)氨基酸殘基(甘氨酸、酪氨酸和蘇氨酸)所組成的，其綠色熒光的產(chǎn)生無(wú)需底物或輔因子，并且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)[5]．

根據(jù)信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)，可將其分為分泌型(Sec)信號(hào)肽、雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)(twin-arginine transolcation，Tat)信號(hào)肽和脂蛋白(Lip)信號(hào)肽等[6]．目前對(duì)Sec

系統(tǒng)的研究已相當(dāng)完善，Sec轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)只能轉(zhuǎn)運(yùn)未折疊或部分折疊的蛋白質(zhì)[7]，而Tat轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可將處于正確折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，在基因工程領(lǐng)域中可以用于分泌無(wú)法通過(guò)Sec系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)的外源蛋白[8]．GFP作為一種理想的報(bào)告蛋白，可以在S.,carnosus內(nèi)表達(dá)[9]，但能否被正確地折疊和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)將取決于所選用的Tat信號(hào)肽序列[10–12]．

穿梭載體是能在2種不同的生物中復(fù)制的載體，通常用于克隆已擴(kuò)增的基因[13]．目前，用于肉葡萄球菌宿主表達(dá)外源蛋白的質(zhì)粒載體基本上都是非穿梭質(zhì)粒，DNA連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化肉葡萄球菌的效率低，轉(zhuǎn)化較困難，而大腸桿菌–葡萄球菌的穿梭質(zhì)粒，如pBT2載體[14]，就很好地解決了這個(gè)問(wèn)題．因此，本實(shí)驗(yàn)以穿梭載體pBT2為骨架，通過(guò)導(dǎo)入強(qiáng)啟動(dòng)子，構(gòu)建高效表達(dá)外源GFP的穿梭載體，探究雙精氨酸分泌信號(hào)肽在肉葡萄球菌中對(duì)GFP的轉(zhuǎn)運(yùn)效果，從而為深入理解肉葡萄球菌中雙精氨酸信號(hào)肽分泌機(jī)理及研究其他外源蛋白在肉葡萄球菌中的表達(dá)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α 由天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏(保藏號(hào)TCCC 11800)；肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)TM300菌株由德國(guó)圖賓根大學(xué)微生物遺傳學(xué)研究所的Goetz教授[3]饋贈(zèng)．pMD19-T Simple Vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌?葡萄球菌穿梭質(zhì)粒pBT2-Tat-GFP由本實(shí)驗(yàn)室以pBT2質(zhì)粒為骨架構(gòu)建得到，其中的Tat信號(hào)肽來(lái)源于肉葡萄球菌的鐵依賴型過(guò)氧化物酶(FepB)[11]．

1.1.2 酶與試劑

Taq DNA聚合酶、1,kbp DNA Ladder和DNA MarkerⅢ購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；T4,DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶Kpn I、Bam HI和低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Fermentas中國(guó)公司．PCR引物合成及DNA測(cè)序工作委托北京六合華大基因科技股份有限公司完成；質(zhì)粒DNA的提取、DNA片段膠回收與產(chǎn)物純化采用購(gòu)自天津?qū)毴鹕锛夹g(shù)有限公司的GeneBond系列試劑盒．其他試劑和藥品為進(jìn)口分析純或生化級(jí)試劑．1.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

大腸桿菌和肉葡萄球菌的培養(yǎng)均使用LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10,g/L，酵母浸提物5,g/L，NaCl 10,g/L，固體培養(yǎng)基含瓊脂20,g/L)．對(duì)于重組菌株的篩選，氨芐青霉素終質(zhì)量濃度為100,μg/mL，氯霉素終質(zhì)量濃度為10,μg/mL．肉葡萄球菌感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)使用B2培養(yǎng)基(酪蛋白10,g/L，酵母浸提物25,g/L，葡萄糖5,g/L，NaCl 25,g/L，K2HPO41,g/L)．電轉(zhuǎn)化孵育使用TSB培養(yǎng)基(胰蛋白胨17,g/L，大豆蛋白胨3,g/L，葡萄糖2.5,g/L，NaCl 5,g/L，K2HPO42.5,g/L)[15]．大腸桿菌和肉葡萄球菌的振蕩培養(yǎng)條件均為37,℃、180,r/min.

1.2 方法

1.2.1 啟動(dòng)子Peftu的擴(kuò)增

編碼EF-Tu(延伸因子)的tuf基因廣泛存在于原核生物中，其主要生物功能是在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中負(fù)責(zé)肽鏈的延伸，而且tuf基因的啟動(dòng)子屬于強(qiáng)啟動(dòng)子，因此根據(jù)S.,carnosusTM300基因組中tufA基因(GenBank ID：7551602)的啟動(dòng)子Peftu序列，設(shè)計(jì)出1對(duì)引物eftu1和eftu2，用于擴(kuò)增啟動(dòng)子Peftu片段. eftu1：5′-GGGTACC TTTTTTGGTAGGGTTCCT GAATT-3′(Kpn I)；eftu2：5′-CGGATCC TATGAAAT CTCTCCTCTTCTTAATAAAA AG-3′(Bam HI)

使用玻璃微珠法[16]提取的肉葡萄球菌基因組為模板，利用引物eftu1和eftu2以PCR法擴(kuò)增啟動(dòng)子Peftu．?dāng)U增采用50,μL體系：ddH2O 17.5,μL，模板2.5,μL，eftu1 2.5,μL，eftu2 2.5,μL，2×Taq PCR MasterMix聚合酶25,μL．?dāng)U增程序?yàn)椋?5,℃ 10,min，94,℃,30,s，62.8,℃ 30,s，72,℃ 30,s，30個(gè)循環(huán)，72,℃10,min．瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收．

1.2.2 pBT2-ETG載體的構(gòu)建

啟動(dòng)子Peftu的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pMD19-T Simple Vector通過(guò)T4 Ligase于16,℃過(guò)夜連接后，使用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.,coli DH5α ，提取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行Kpn I/Bam HI雙酶切驗(yàn)證及PCR驗(yàn)證．挑取攜帶有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子E.,coli DH5α 單菌落接種在含Amp的LB培養(yǎng)液中，37,℃、180,r/min過(guò)夜培養(yǎng)，培養(yǎng)物送至北京六合華大基因科技股份公司進(jìn)行測(cè)序．

使用Kpn I/Bam HI對(duì)質(zhì)粒pBT2-Tat-GFP進(jìn)行雙酶切，用DNA片段純化回收試劑盒純化回收相應(yīng)的酶切產(chǎn)物，與測(cè)序正確并經(jīng)相同雙酶切的PCR產(chǎn)物通過(guò)T4,Ligase于16,℃進(jìn)行過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物使

用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.,coli DH5α 宿主細(xì)胞中，提取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行Kpn I/Bam HI雙酶切驗(yàn)證及PCR驗(yàn)證，并將該質(zhì)粒命名為pBT2-ETG，其圖譜見(jiàn)圖1．

1.2.3 肉葡萄球菌的電轉(zhuǎn)化

參照Gao等[17]改進(jìn)的方法將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化進(jìn)入肉葡萄球菌，并對(duì)轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和PCR驗(yàn)證．

1.2.4 GFP的表達(dá)

分別接種陽(yáng)性重組菌株S.,carnosusTM300/pBT2-ETG、S.,carnosusTM300/pBT2-Tat-GFP、E. coli/pBT2-ETG、E.,coli/pBT2-Tat-GFP，陰性對(duì)照菌株S.,carnosusTM300、E.,coli DH5α 于5,mL LB培養(yǎng)液中，37,℃、180,r/min過(guò)夜培養(yǎng)；轉(zhuǎn)接0.5,mL過(guò)夜培養(yǎng)物于50,mL LB培養(yǎng)液中，37,℃、180,r/min繼續(xù)培養(yǎng)16,h，以表達(dá)GFP．

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物GFP的檢測(cè)

熒光顯微鏡觀察：各取10,μL按1.2.4方法培養(yǎng)的菌液，滴在載玻片表面并蓋好蓋玻片后，置于熒光顯微鏡下觀察各菌液的熒光產(chǎn)生情況．

SDS-PAGE與Native-PAGE分析：參考Meissner等[10]的方法，分別提取陽(yáng)性重組菌株與陰性對(duì)照菌株的細(xì)胞壁和原生質(zhì)體中蛋白組分，以發(fā)酵液為對(duì)照，使用5%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行SDSPAGE與Native-PAGE檢測(cè)．

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子Peftu片段的PCR擴(kuò)增

通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增Peftu片段產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，在200,bp附近出現(xiàn)特異的單一DNA條帶．將PCR產(chǎn)物與pMD19-T Simple Vector連接后進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過(guò)DNA序列比對(duì)，PCR產(chǎn)物與目的基因序列一致．PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖2．

2.2 pBT2-ETG載體的構(gòu)建

Kpn,I/Bam,HI雙酶切在大腸桿菌中構(gòu)建的pBT2-ETG載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示在200,bp與8,kbp附近分別出現(xiàn)DNA條帶，與預(yù)計(jì)的目的片段大小一致，初步證明啟動(dòng)子Peftu已成功地克隆到pBT2-Tat-GFP載體中．酶切產(chǎn)物電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖3．

2.3 肉葡萄球菌的轉(zhuǎn)化驗(yàn)證

肉葡萄球菌培養(yǎng)物經(jīng)玻璃微珠破壁，使用GeneBond試劑盒提取pBT2-ETG質(zhì)粒，Kpn I/Bam HI雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，在200,bp和8,kbp附近出現(xiàn)DNA條帶，與預(yù)計(jì)的目的基因片段大小一致，說(shuō)明穿梭載體pBT2-ETG已成功轉(zhuǎn)化入肉葡萄球菌宿主中．肉葡萄球菌重組質(zhì)粒pBT2-ETG的Kpn,I和Bam HI雙酶切驗(yàn)證分析結(jié)果見(jiàn)圖4．

2.4 熒光顯微鏡觀察

使用NIKON ECLIPSE TE2000–U型熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化子菌液，結(jié)果如圖5所示．

由圖5可以看出，構(gòu)建成功的重組大腸桿菌和肉葡萄球菌宿主菌株均能發(fā)出熒光，說(shuō)明pBT2-ETG載體編碼的GFP能夠表達(dá)并正確折疊，是具有活性的蛋白質(zhì)．

2.5 SDS-PAGE分析

經(jīng)玻璃微珠破碎，分別提取S. carnosusTM300重組菌株與對(duì)照菌株的細(xì)胞壁和原生質(zhì)體進(jìn)行SDSPAGE蛋白電泳，結(jié)果見(jiàn)圖6．同時(shí)對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行蛋白電泳分析，以確定GFP是否能夠分泌到宿主細(xì)胞外的培養(yǎng)基中．

本研究中，經(jīng)N-末端修飾的目的蛋白GFP的相對(duì)分子質(zhì)量約為3×104．在圖6中重組菌株細(xì)胞壁部位所在的泳道出現(xiàn)了目的條帶，這表明GFP蛋白成功表達(dá)并轉(zhuǎn)運(yùn)到肉葡萄球菌宿主細(xì)胞的細(xì)胞壁部位．但是發(fā)酵液的蛋白電泳圖在目的位置沒(méi)有出現(xiàn)目的條帶，說(shuō)明GFP蛋白未能分泌到胞外(圖略)．

2.6 Native-PAGE分析

為檢測(cè)重組菌株表達(dá)的GFP是否具有活性，提取出E. coli DH5α 重組菌株、S. carnosusTM300重組菌株及其對(duì)照菌株的細(xì)胞壁和原生質(zhì)體進(jìn)行了Native-PAGE活性蛋白電泳，結(jié)果如圖7所示．

在圖7中可以看出，如箭頭所指方向，GFP目的條帶出現(xiàn)在重組菌株S. carnosusTM300/pBT2-ETG的細(xì)胞壁部位(泳道6)，這表明重組菌株S. carnosusTM300/pBT2-ETG表達(dá)的活性GFP成功地分泌到了宿主細(xì)胞壁部位．

3 結(jié) 語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建大腸桿菌–肉葡萄球菌穿梭質(zhì)粒pBT2-ETG的過(guò)程中，先將目的基因與構(gòu)建的連接產(chǎn)

物高效地轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，通過(guò)大腸桿菌繁殖擴(kuò)增獲得了大量重組質(zhì)粒，再提取此重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入肉葡萄球菌，從而較好地解決了連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化肉葡萄球菌效率較低的問(wèn)題．

穿梭質(zhì)粒pBT2-Tat-GFP引入的強(qiáng)啟動(dòng)子Peftu可以使融合基因tat-gfp在大腸桿菌與肉葡萄球菌宿主中均得到高效表達(dá)，并通過(guò)Tat信號(hào)肽的作用，將GFP正確折疊并轉(zhuǎn)運(yùn)至肉葡萄球菌細(xì)胞壁部位．該強(qiáng)啟動(dòng)子通過(guò)提高外源蛋白在肉葡萄球菌中的表達(dá)效率，使得pBT2表達(dá)載體系統(tǒng)易于進(jìn)行克隆操作．本研究的成果也為相應(yīng)的細(xì)胞表面展示與活菌疫苗等的研發(fā)奠定了理論與應(yīng)用的基礎(chǔ)．

致謝：本文受天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金資助(項(xiàng)目編號(hào)：20120803)，謹(jǐn)致謝忱！

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責(zé)任編輯：常濤

GFP Translocation of Twin-arginine Secretion Pathway in Staphylococcus carnosus

GAO Qiang1，XU Baoyin1，CHENG Yibing1，WANG Lin2，ZHANG Chaozhen1，TIAN Pingping1

(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. College of Computer Science and Information Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300222，China)

According to the genome sequence ofStaphylococcus carnosusTM300 genome，a pair of primers was designed for PCR amplification of promoter Peftu of tufA gene. The PCR-amplified promoter Peftu fragment was cloned into plasmid pBT2-Tat-GFP and chemically transformed into E. coli host. A shuttle vector pBT2-ETG was thereby constructed and successfully transformed intoE. coli and S. carnosusTM300 hosts，respectively. The experimental results reveal that GFP was expressed by theE. coli-Staphylococcusshuttle vector pBT2-ETG in bothE. coliandS. carnosushosts. The expressed GFP was translocated to the cell walls of S. carnosus host in fluorescent active form. Thereby，a preliminary experimental basis was laid for the further study of other exogenous protein secretion via twin-arginine translocation pathway inS. carnosus.

Staphylococcus carnosus；GFP；twin-arginine translocation pathway；promoter Peftu；Tat signal peptide

Q933

A

1672-6510(2014)05-0001-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.001

2014–01–18；

2014–04–20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31370075，31101275)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”資助項(xiàng)目(2012AA021302)

高 強(qiáng)（1965—），男，陜西府谷人，教授，gaoqiang@tust.edu.cn.