劉兆喆，郝 輝，郭 放，韓 濤，韓雅玲，謝曉冬

遠處轉(zhuǎn)移幾乎是所有乳腺癌患者的死亡原因，腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移灶的停留和生長都是引起繼發(fā)性遠處轉(zhuǎn)移的必要步驟［1］。在臨床上將這些常規(guī)病理學(xué)和影像學(xué)檢查不能發(fā)現(xiàn)的腫瘤細胞播散定義為微轉(zhuǎn)移，早期檢測出微轉(zhuǎn)移并對其進行臨床干預(yù)是改善患者預(yù)后的重要方法。有研究表明，乳腺上皮粘蛋白(SBEM)基因可能作為特異性的分子標記物來檢測乳腺癌患者骨髓中腫瘤播散細胞，并可作為監(jiān)測骨髓微轉(zhuǎn)移變化情況的重要指標［2-3］，且其在三陰乳腺癌患者中表達較高，有望成為三陰乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測分子［4］。本研究擬在細胞水平對SBEM基因的表達情況進行研究，并進一步篩選出蛋白的保護性抗原表位，為乳腺癌免疫治療提供理想的干預(yù)靶點，進而指導(dǎo)基因疫苗的設(shè)計。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細胞株MDA-MB-231(購自中科院上海細胞研究所)。

1.2 主要試劑、儀器 即用型免疫組織化學(xué)超敏UltraTMSP試劑盒(北京中杉金橋公司)，流式細胞儀B0091(美國BD公司)，總RNA提取液TRIZOL、DNA Mark及Premix Taq(大連寶生物公司，中國)，RT-PCR試劑盒(TransGen Biotech公司，中國)，低溫離心機(Thermo)，PCR儀(美國PE公司)、凝膠電泳及成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。引物由大連寶生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng):在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)，細胞單層貼壁生長，待長至80% ～90%細胞發(fā)生融合時，棄去培養(yǎng)液。用1 ml 0．25%胰酶EDTA溶液消化，收集細胞，進行細胞計數(shù)，并傳代培養(yǎng)。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR):應(yīng)用TRIZOL法提取總RNA。取適量RNA溶液，紫外分光光度定量，按1 OD(260 nm)=40μg的標準，A260/A280的比值為1．8～2．1。應(yīng)用RT-PCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。SBEM和GAPDH mRNA的反應(yīng)條件:預(yù)變性 94℃、5 min，35個循環(huán);94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s;延伸 72℃、8 min。

1.3.3 免疫細胞化學(xué)法:收集細胞，獲得約1×105/100μl細胞懸液，取50～100μl接種至96孔板。次日，觀察細胞貼壁情況，PBS洗滌3次;加入50μl、95%乙醇，室溫固定 10 min;棄上清，PBS洗滌3次，加入50μl過氧化酶阻斷液(試劑A)，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，加入一滴非免疫的動物血清(試劑B)，室溫孵育10 min;棄去血清，加入50μl SBEM抗體(1∶50)，4℃過夜;PBS洗滌3次，加入50μl生物素標記的第二抗體(試劑C)，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，加入50μl鏈霉素抗生素－過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫孵育10 min;PBS洗滌3次，加入100μl新鮮配制的DAB溶液，染色1～3 min;PBS洗滌1次，顯微鏡下拍照。

1.3.4 流式細胞術(shù):收集細胞，密度為5×105/100μl，取200μl細胞懸液加入標記好的流式管中，4℃，1400 rpm離心 5 min;棄上清，加入 100μl SBEM一抗(1∶1000)，4℃孵育過夜;次日，4℃，1400 rpm離心5 min，PBS洗滌2次;加入100μl FITC標記的羊抗兔二抗(1∶100)，4℃避光孵育30 min;陰性對照組未加SBEM一抗，僅加入二抗;PBS洗滌2次，加入400μl PBS液重懸細胞，上機進行檢測。

1.3.5 電泳分析:PCR擴增產(chǎn)物由EB替代染色，電泳條件:2%瓊脂糖凝膠，0．5×TBE，恒壓100 V，約30 min。在凝膠電泳成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.4 表位預(yù)測 通過生物信息學(xué)的方法，結(jié)合SYFPEITHI和ProPred-I表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用多種參數(shù)進行分析，預(yù)測SBEM蛋白的白細胞抗原(HLA)-A*0201限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，α=0．05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果 SBEM mRNA在MDA-MB-231細胞中呈高表達，見圖1。Quantity One凝膠分析軟件計算 SBEM/GAPDH(光密度比值)為(2．25±0.22)%。

圖1 乳腺上皮粘蛋白mRNA在MDA-MB-231細胞中的表達

2.2 免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果 免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，SBEM蛋白在MDA-MB-231細胞膜上呈高表達，見圖2。

圖2 乳腺上皮粘蛋白在MDA-MB-231細胞中的表達(DAB×400)

2.3 流式細胞術(shù)結(jié)果 流式細胞術(shù)檢測SBEM蛋白在 MDA-MB-231細胞上的表達率為(76．3±6.6)%;陰性對照組表達率為(2．6±1．1)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，見圖3。

圖3 乳腺上皮粘蛋白在MDA-MB-231細胞的表達

2.4 SBEM蛋白的氨基酸序列 通過NCBI網(wǎng)站獲得SBEM蛋白的 GenBank登錄號，為 Accession:EAW96795．1 GI:119617201。SBEM蛋白含有90個氨基酸，具體如下:mkflavlvllgvsiflvsaqnpttaapadtypatgpaddeapdaettaaattattaapttattaasttarkdipvlpkwvgdlp ngrvcp。

2.5 SYFPEITHI法預(yù)測HLA-A*0201限制性CTL表位結(jié)果 通過SYFPEITHI預(yù)測法，得到HLA-A*0201限制性CTL表位結(jié)果見表1(僅將得分≥18的9肽序列列出)，其中分值＞20的9肽共5條，分值由高到低分別為 9-17，8-16，75-83，6-14，4-12。

表1 SBEM蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位(9肽)

2.6 ProPred-I預(yù)測法結(jié)果 通過ProPred-I法，得到HLA-A*0201限制性CTL表位結(jié)果如表2，其中分值＞20的9肽共2條，分值由高到低分別為9-17，8-16。

表2 ProPred-Ⅰ法得到HLA-A*0201限制性CTL表位(9肽)

3 討論

SBEM是2002年5月Richard等［5］利用公共序列標簽表達的同位素標記技術(shù)和基因表達系列分析數(shù)據(jù)庫首次報道的一種基因。其表達具有特異性，僅在乳腺和唾液腺中表達，與MUC-1相比具有高度特異性，是有望用于乳腺癌微轉(zhuǎn)移檢測的分子標志物。

有研究表明，SBEM蛋白表達與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［6-8］。乳腺癌患者外周血中SBEM mRNA表達陽性率為55．96%(61/109)，與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。SBEM mRNA表達與激素受體和CerbB-2之間雖然沒有相關(guān)性，但在ER/PR(－)患者中SBEM的表達較ER/PR(+)的患者高，表明SBEM基因與不良預(yù)后因素之間存在關(guān)聯(lián)，可作為獨立的分子標記物篩查出部分具有高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險的乳腺癌患者［9］。此外，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)監(jiān)測新輔助化療前后SBEM基因表達水平的變化，發(fā)現(xiàn)在3周期化療后，58%乳腺癌患者SBEM基因的表達水平有所下調(diào)，提示SBEM基因有望成為預(yù)測新輔助化療療效的分子標記物［9］。但到目前為止，鮮有研究者在細胞水平上對SBEM蛋白進行研究，而且該蛋白在乳腺癌免疫治療中的研究尚未見報道。

本研究選取 ER(－)、PR(－)、HER-2(－)的MDA-MB-231乳腺癌細胞系作為對象，應(yīng)用免疫細胞化學(xué)、流式細胞術(shù)和RT-PCR 3種實驗方法，分別檢測SBEM蛋白和基因在細胞中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SBEM mRNA和蛋白在MDA-MB-231細胞中呈高表達，提示其表達水平與乳腺癌細胞的病理類型相關(guān)。研究顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血清中SBEM含量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，Ⅲ+Ⅳ期患者亦顯著高于Ⅰ+Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，SBEM高表達的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性較大［6］。本研究從乳腺癌細胞水平上驗證了SBEM高表達與乳腺癌惡性程度有相關(guān)性，為后續(xù)進一步篩選SBEM蛋白的保護性抗原表位肽奠定了重要的實驗基礎(chǔ)。

抗原表位又稱抗原決定簇，是指抗原分子上能刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞并能夠被其識別的一個免疫活性區(qū)。免疫細胞通常難以借助其表面受體識別整個蛋白質(zhì)分子，而僅識別抗原肽分子上的表位［10］。按與抗原受體結(jié)合細胞的不同，分為B細胞抗原表位和T細胞抗原表位?？乖砦坏难芯繉Χ嚯暮托滦突蛞呙绲脑O(shè)計研發(fā)具有重要意義。目前，常用的免疫信息學(xué)方法包括基于基序法的WAPPP、基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法的PAProc等［11-12］。采用免疫信息學(xué)預(yù)測方法，不但可以提高發(fā)現(xiàn)新表位的效率，而且能減少實驗室工作量，節(jié)約大量研究經(jīng)費。SBEM蛋白是MUC家族成員，僅有90個氨基酸序列，在乳腺癌細胞膜上呈高表達，可能通過掩蓋腫瘤細胞抗原引起免疫逃避，故對其保護性抗原表位進行篩選，可為確定候選肽段和重組核酸疫苗提供重要的實驗基礎(chǔ)。在我國人群的HLA-Ⅰ類抗原中，A2抗原頻率高達53%，因此尋找SBEM抗原HLA-A2限制性CTL表位具有重要的現(xiàn)實意義［13］。

本研究運用MHC配體和抗原表位肽數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI預(yù)測，將分值較高的抗原肽再基于結(jié)構(gòu)的表位預(yù)測算法MHCpred 2．0進行結(jié)構(gòu)親和性分析。把初選的九肽通過蛋白酶體裂解基序NETChop 3．0 server酶切分析。最終篩選出兩條最具有親和力的九肽:LLGVSIFLV(9-17)和VLLGVSIFL(8-16)。通過生物信息學(xué)方法預(yù)測抗原表位，有助于基因疫苗的研制及抗體藥物的研制和開發(fā)。總之，本研究在細胞水平對SBEM基因的表達進行研究，并篩選出乳腺癌高表達SBEM抗原表位，為個體化治療乳腺癌轉(zhuǎn)移提供理想的干預(yù)靶點及新思路。

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