王 強(qiáng)，馮 博，張 沂，任婷麟

·航海醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化·

伏立康唑在海水浸泡致低體溫家兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)變化研究

王 強(qiáng)，馮 博，張 沂，任婷麟

目的研究低體溫對伏立康唑藥代動力學(xué)的影響。方法20只家兔隨機(jī)均分為低體溫組和對照組。低體溫組采用（21±1）℃海水浸泡60min致低體溫造模。給予2組兔單劑量伏立康唑（10 mg／kg），取血并監(jiān)測體溫，高效液相色譜法測定不同時間點(diǎn)伏立康唑血藥濃度，3P97軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果低體溫組動物體溫在浸泡過程中及出水后一段時間持續(xù)下降，在36 h后恢復(fù)正常（36.6±0.8）℃。伏立康唑在低體溫組和對照組兔體內(nèi)藥代動力學(xué)發(fā)生變化，藥物半衰期和清除率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但達(dá)峰時間、藥物濃度-時間曲線下面積（area under concentration-time curve，AUC0-t）或AUC0-∞差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論伏立康唑在海水浸泡致低體溫家兔體內(nèi)清除減慢。

伏立康唑；藥代動力學(xué)；低體溫

動物較長時間浸泡于海水中，可導(dǎo)致機(jī)體體溫下降且在出水后維持相當(dāng)長一段時間［1］。在低體溫內(nèi)環(huán)境下，機(jī)體的體液［2］、血流動力學(xué)［3］、血液生化、血?dú)饧芭K器功能［4］等發(fā)生復(fù)雜的生理或病理變化，這些變化可能影響藥物體內(nèi)處理過程。研究顯示，左氧氟沙星在人工海水浸泡致低體溫比格犬體內(nèi)半衰期變長、代謝趨緩［4］。

海洋中含有多種真菌，在我國海域主要有子囊菌屬、擔(dān)子菌屬、酵母菌屬等，包括多種條件致病菌。長期在船上生活、作業(yè)或者受傷落水，容易導(dǎo)致真菌感染［5］。伏立康唑（voriconazole，VOZ）是第二代三唑類抗真菌藥，為臨床一線口服抗真菌藥物，具有抗菌譜廣、生物利用度高、可通過血腦屏障等特點(diǎn)。對多種真菌具有良好的抗菌作用，臨床上可用于治療急、慢性深部真菌感染、侵襲性去霉菌病、新型隱球菌性腦膜炎、進(jìn)行性有致命危險的免疫損害患者等［6］。本文擬建立家兔海水浸泡致低體溫模型，探討伏立康唑在其體內(nèi)藥代動力學(xué)變化，為伏立康唑在低體溫機(jī)體中合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性健康中國大白兔20只，體質(zhì)量（2.4±0.4）kg，由北京市興隆實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心提供，合格證號SCXK（京）2012-0001。

1.2 主要試劑及儀器 美國Waters高效液相色譜儀（包括1525二元高壓梯度泵、2487紫外檢測器、STD3101-1柱溫箱、在線脫氣機(jī)、717自動進(jìn)樣器、Empower工作站）；MDFU52V超低溫保存箱（日本，三洋公司）；KQ400KDE臺式高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；X-250超聲波清洗器（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）；TG-16G高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；VOZ，每片200 mg，批號121020，美國輝瑞公司；伏立康唑?qū)φ掌?，中國藥品生物制品檢定所，批號100862-200701；內(nèi)標(biāo)卡馬西平，中國藥品生物制品檢定所，批號100142-201004；乙腈、甲醇為色譜純，美國Fisher公司；冰乙酸、三乙胺、正己烷與乙酸乙酯均為分析純，氫氧化鈉（sodium hydroxide，NaOH）為化學(xué)純，均購于北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；超純水為超純水器（Millii-Q plus，美國，Millipore公司）自制。

1.3 方法

1.3.1 人工海水配制 人工海水配制參照中國國家海洋局第三研究所海洋化學(xué)研究室提供的《我國東南沿海海水主要成分配方》配制，NaCl26.520、MgCl22.447、MgSO43.305、CaCl21.414、KCl 0.725、NaHCO30.202、NaBr 0.083 g／L，人工海水水溫（21± 1）℃，滲透壓（1 250～1 350）mmol／L，pH為8.20，相對密度1.05～1.06。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動物分組 全部實(shí)驗(yàn)在室溫（25±2）℃下進(jìn)行。家兔實(shí)驗(yàn)前禁食過夜，自由飲水。實(shí)驗(yàn)用前準(zhǔn)確稱重，隨機(jī)分為對照組和低體溫組（每組10只）。低體溫組動物實(shí)驗(yàn)中將其固定于海水浸泡池中浸泡60 min降低體溫。對照組兔在相同環(huán)境條件下，但不在海水中浸泡。

1.3.3 給藥方案與取血時間 低體溫組兔撈出測體溫，擦干后與對照組兔同時按10mg／kg給予VOZ，分別于給藥前和給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36 h取血，置于肝素鋰管中，3 000 r／min離心5min，小心吸取上層血漿，于－70℃保存待測。

1.3.4 體溫測量 所有兔在給藥前及給藥后1、2、4、6、12、24、36、48 h測量體溫。低體溫組增加浸泡前和浸泡30、60 min體溫測量。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取VOZ標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于10 mL干燥容量瓶中，用色譜純甲醇溶解至刻度得VOZ標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（1 mg／mL），－70℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。同法精密稱取內(nèi)標(biāo)卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度得卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（1 mg／mL）。2種儲備液在使用時加甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為20μg／mL。

1.3.6 血漿標(biāo)本處理 取待測血漿標(biāo)本0.5 mL，加入20μL卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)溶液（20μg／mL），渦旋混勻30 s；再加入100μL預(yù)先配好的0.8mol／LNaOH溶液，渦旋混勻30 s；加入乙酸乙酯-正己烷（3∶1）3.7 mL，渦旋3次，每次混勻3 min；末次渦旋后迅速3 000 r／min離心5 min，取上層液，氮?dú)獯蹈?；殘?jiān)?00μL流動相溶解、混勻，12 000 r／min離心3 min，取上清液20μL進(jìn)樣分析［7］。

1.3.7 色譜條件 色譜柱Symmetry C18（3.9 mm× 150 mm，5μm，美國，Waters公司），柱溫35℃；流動相乙腈∶水∶冰醋酸∶三乙胺為39∶60∶0.1∶0.9；流速1.4 mL／min，檢測波長256 nm；進(jìn)樣量20μL。色譜圖見圖1。

圖1 VOZ高效液相色譜圖

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取兔給藥前血漿0.5 mL，置于5mL具塞離心管中，加VOZ標(biāo)準(zhǔn)液配制為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 mg／L質(zhì)量濃度樣品。按血漿標(biāo)本處理方法處理后進(jìn)樣。以VOZ質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，VOZ與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計算，得回歸方程：Y＝0．768 8X－0.001 7，r＝0.999 6。線性范圍為10～2 000 mg／L。最低質(zhì)量濃度為10 mg／L。

1.3.9 精密度、回收率實(shí)驗(yàn)和樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將給藥前血漿配制成5、100、200 mg／L質(zhì)量濃度樣品，按血漿標(biāo)本處理方法處理、測定，計算其日內(nèi)和日間精密度（3 d內(nèi)）。結(jié)果3個不同質(zhì)量濃度樣品的日內(nèi)和日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜5%。

取兔空白血漿0.5 mL，分別置于5 mL的離心管，再精密配制成5、100、200 mg／L質(zhì)量濃度的樣品，按血漿標(biāo)本處理方法操作，每一質(zhì)量濃度進(jìn)行5樣本分析，用VOZ、卡馬西平的峰面積與相同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣測得的VOZ、卡馬西平的峰面積之比計算其絕對回收率。結(jié)果表明，3個不同質(zhì)量濃度回收率分別為88.29%、90.05%和89.33%。取給藥前兔血漿0.5 mL，分別置于5 mL的離心管，再精密配制成5、100、200 mg／L質(zhì)量濃度的樣品，在即時、－70℃冷凍保存7 d及28 d后各測定3次。結(jié)果3個不同質(zhì)量濃度樣品，在3個保存時間無明顯變化。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)兔體溫 對照組兔在整個藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)中體溫未見明顯變化，觀測到最高體溫（37.2± 0.3）℃，最低體溫（36.8±0.2）℃。低體溫組兔在浸入人工海水后體溫迅速下降，最低達(dá)（29.5±2.6）℃，并在出水后繼續(xù)下降至（26.4±4.1）℃，直到藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)36 h時體溫為（36.6±0.8）℃接近正常（圖2）。

圖2 不同時間點(diǎn)兔體溫變化（ˉx±s）

2.2 藥代動力學(xué) 2組兔給予VOZ后血藥物濃度-時間變化見圖3。經(jīng)3P97軟件擬合后主要動力學(xué)參數(shù)見表1。與對照組比較：低體溫組VOZ的半衰期從（6.72±0.87）h增長為（9.95±1.79）h（P＜0.05）；對VOZ的藥物清除率從（42.68±7.58）L／h明顯下降至（24.95±10.36）L／h（P＜0.05）；Cmax及AUC0-t、AUC0-∞上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而tmax變化不大。

圖3 藥物濃度-時間曲線（ˉx±s）

表1 主要藥代動力學(xué)參數(shù)（ˉx±s）

3 討論

VOZ作為目前一線廣譜抗真菌用藥，能用于治療侵襲性曲霉菌、對氟康唑耐藥的念珠菌引起的嚴(yán)重侵襲性感染以及由足放線病菌屬和鐮刀菌屬引起的嚴(yán)重感染。VOZ的藥效嚴(yán)重受其血藥濃度影響，但VOZ在人體內(nèi)的代謝方式較復(fù)雜，常以非線性動力學(xué)的方式進(jìn)行代謝。因此，臨床上對VOZ的使用方式不盡一致，導(dǎo)致VOZ的不良反應(yīng)報道上升［8］。同時，VOZ與免疫調(diào)節(jié)藥他克莫司、抗生素如左氧氟沙星、三環(huán)類鎮(zhèn)靜藥苯巴比妥等合用，這些藥物能影響細(xì)胞色素（cytochrome，CY）P450酶功能，進(jìn)而影響VOZ的體內(nèi)過程。因此，研究影響VOZ體內(nèi)過程的因素，對VOZ合理使用具有重要意義。

臨床上，生物低體溫狀況并不少見，通常在意外和醫(yī)療過程中發(fā)生。意外常見于嚴(yán)寒、落水后海水浸泡、長時間水下或礦井作業(yè)（被困井下）、嚴(yán)重創(chuàng)傷等。如本實(shí)驗(yàn)中家兔在（21±1）℃的人工海水浸泡后體溫迅速下降至（29.5±2.6）℃，并且在出水后一段時間內(nèi)體溫持續(xù)下降至（26.4±4.1）℃，說明長時間的海水浸泡可導(dǎo)致動物處于較嚴(yán)重的低體溫狀態(tài)。醫(yī)療過程低體溫常見于體外循環(huán)心臟直視手術(shù)及某些藥物如麻醉藥、鎮(zhèn)靜催眠藥誘發(fā)的低體溫，大手術(shù)過程中由于暴露的器官較多，使機(jī)體散熱增加；大量快速輸液或輸血可使體溫下降；近年被臨床關(guān)注、研究和應(yīng)用的治療性亞低溫。低體溫具有中樞神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用和緩解心肌缺血的作用，可減少有害的細(xì)胞內(nèi)蛋白水解反應(yīng)、血腦屏障受損，減少神經(jīng)元的損傷、延緩或阻斷缺血性細(xì)胞死亡的發(fā)生等［9-11］。但研究也發(fā)現(xiàn)，低體溫可影響多種藥物的體內(nèi)過程，如導(dǎo)致芬太尼、嗎啡和苯巴比妥等的半衰期延長、體內(nèi)清除延遲［12-14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VOZ在自制人工海水浸泡導(dǎo)致的持續(xù)低體溫兔模型其半衰期延長、清除率降低，但生物利用度沒有變化。說明單劑量VOZ在低體溫兔體內(nèi)代謝減慢，長期使用VOZ可能導(dǎo)致藥物蓄積增加，不良反應(yīng)增加。但臨床使用時是否需要進(jìn)行劑量校正，還需進(jìn)一步臨床血藥濃度監(jiān)測或群體藥代動力學(xué)試驗(yàn)研究。

低體溫對機(jī)體生理活動影響較大。在低體溫狀態(tài)下，體內(nèi)多種酶、功能蛋白的活性及多種基因表達(dá)均會有顯著變化，肝、腎等重要臟器可發(fā)生病理組織學(xué)改變［2，4］。而VOZ在體內(nèi)主要經(jīng)細(xì)胞色素P450酶系代謝，如CYP3A4、CYP2C9及CYP2C19等，其中主要是CYP2C19。CYP2C19的催化能力受多種因素影響，如藥物、基因及環(huán)境突變等［15］。李向陽等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在高原環(huán)境下（＞4 000 m）大鼠CYP2C19活性發(fā)生改變并影響其底物奧美拉唑的代謝。因此，VOZ在低體溫組兔體內(nèi)代謝改變，可能與CYP2C19或其他代謝酶在低體溫內(nèi)環(huán)境下活性或表達(dá)發(fā)生變化有關(guān)，但低體溫引起CYP450酶活性發(fā)生改變的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。同時，由于肝、腎臟器及全身血流動學(xué)在低體溫時也會發(fā)生變化，同樣可能影響VOZ的代謝清除。低體溫導(dǎo)致VOZ在體清除減緩的具體機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

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Pharmacokinetics changes of voriconazole in seawater immersed hypothermic rabbits

WANGQiang1，F(xiàn)ENG Bo2，ZHANG Yi1，REN Tingling1
（1.Department of Pharmacy，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Department of Medical Information，Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

ObjectiveTo investigate the pharmacokinetic changes of voriconazole（VOZ）in seawater immersed hypothermic rabbits.MethodsTwenty healthy rabbits were randomly assigned to two groups（n＝10）：hypothermic group and control group.Rabbits in hypothermic group were immersed into（21±1）℃seawater for 60 mins before administration.All the rabbits were administered a single oral dose of 10 mg／kg VOZ.The temperature and VOZ in plasma of the rabbits at different sampling time were determined.Pharmacokinetic parameterswere calculated by 3P97 software.ResultsThe temperature of hypothermic rabbitswere declined during and after the seawater immersion，and back to normal at36 h after immersion（36.6±0.8）℃.Pharmacokinetic of voriconazole was changed.Compared with rabbits in control group，half-life time（t1／2）and（clearances）CLs of hypothermia rabbits were significantly reduced（P＜0.05），but tmax，area under concentration-time curve（AUC0-t），and AUC0-∞had no significant difference（P＞0.05）.ConclusionClearance of voriconazole in seawater immersed hypothermia rabbits slowed down.

Voriconazole（VOZ）；Pharmacokinetics；Hypothermia

R978.5

A

2095-3097（2014）04-0216-04

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.04.007

2014-02-11 本文編輯：徐海琴）

國家自然科學(xué)基金（81273598）

100048北京，海軍總醫(yī)院藥劑科（王 強(qiáng)，張 沂，任婷麟），信息科（馮 博）

張 沂，E-mail：pharmacynavy＠126.com