伍玉婷，梁華晟

·技術(shù)與方法·

基于嵌合抗原受體的腫瘤免疫治療

伍玉婷，梁華晟

腫瘤可通過(guò)下調(diào)激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)必需成分的表達(dá)，或通過(guò)分泌免疫抑制因子等機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和攻擊，從而得以在體內(nèi)生存和惡性增殖。利用基因工程技術(shù)修飾T細(xì)胞，設(shè)計(jì)一種可特異性識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的嵌合抗原受體，使其同時(shí)兼具細(xì)胞免疫治療和抗體免疫治療的優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)迅速發(fā)展的腫瘤過(guò)繼免疫治療方法。

嵌合抗原受體；過(guò)繼免疫治療

過(guò)繼免疫療法是將體外活化和擴(kuò)增的自體或異體免疫效應(yīng)細(xì)胞輸給免疫功能低下者，使其獲得抗腫瘤免疫力的一種免疫療法。然而在過(guò)去的20年當(dāng)中，傳統(tǒng)過(guò)繼免疫療法對(duì)卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等大多數(shù)腫瘤的治療均未取得令人滿(mǎn)意的療效。近年來(lái)，以嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CARs）修飾T細(xì)胞為代表的腫瘤靶向免疫治療具有高效的特異性，主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）非限制性、持久的體內(nèi)免疫活性等特點(diǎn)，一旦與靶細(xì)胞結(jié)合，胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)將信號(hào)傳入T細(xì)胞，激活T細(xì)胞，分泌多種細(xì)胞因子［穿孔素、顆粒酶、干擾素（interferon，IFN）-γ、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等］，通過(guò)細(xì)胞毒活性和局部炎癥等旁效應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用，使得過(guò)繼免疫療法重新煥發(fā)出新的生命力。

1 CARs的發(fā)展

1987年，Kuwana［1］課題組首次將免疫球蛋白的V區(qū)與T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）的α和β鏈的恒定區(qū)融合，構(gòu)建了可特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的CAR-T細(xì)胞原型。第一代CARs是由單鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域（single chain Fvdomain，scFv）和免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）連接而成的，由于其修飾的T細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞因子分泌水平低下，無(wú)法提供持續(xù)的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)而逐漸淘汰。近來(lái)引入CD28、4-1BB、OX40、DAP10等共刺激分子（costimulatory molecule，CM），設(shè)計(jì)出以scFv-CM-ITAM嵌合模式為特點(diǎn)的第二代（單共刺激分子）和第三代CARs（雙共刺激分子），有效刺激了T細(xì)胞的持久增殖，提升了細(xì)胞殺瘤活性，延長(zhǎng)了細(xì)胞存活時(shí)間，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放（圖1），在淋巴瘤［2］、卵巢癌［3］、神經(jīng)母細(xì)胞瘤［4］、慢性淋巴細(xì)胞性白血?。?］等疾病的臨床應(yīng)用研究中取得了不俗的成績(jī)。

圖1 三代嵌合抗原受體

2 CARs的腫瘤免疫治療效應(yīng)

CAR-T細(xì)胞通過(guò)scFv與靶細(xì)胞胞外抗原特異結(jié)合，將信號(hào)傳入T細(xì)胞從而激活T細(xì)胞，從而通過(guò)分泌穿孔素、顆粒酶等發(fā)揮直接細(xì)胞毒作用，通過(guò)Fas／FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，通過(guò)白介素（interleukin，IL）-2、IFN-γ、粒細(xì)胞集落刺激因子、TNF-α等細(xì)胞因子產(chǎn)生的旁效應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用，通過(guò)炎性細(xì)胞因子引起腫瘤局部炎癥反應(yīng)，還可通過(guò)干擾腫瘤組織的血管營(yíng)養(yǎng)系統(tǒng)、激發(fā)機(jī)體的免疫效應(yīng)細(xì)胞等發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［6］。IL-2是最早用于過(guò)繼免疫治療的細(xì)胞因子，它具有激活和擴(kuò)增T、B細(xì)胞，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞殺傷活性，誘導(dǎo)殺瘤細(xì)胞產(chǎn)生的作用，還能促I(mǎi)FN、TNF等重要細(xì)胞因子的分泌。研究證明，外源性IL-2的加入對(duì)于T細(xì)胞的激活和增殖、免疫功能的發(fā)揮都具有重要作用，Kochenderfer等［7］在以抗CD19的CAR-T細(xì)胞治療B細(xì)胞惡性腫瘤時(shí)輔用大劑量IL-2，使得B細(xì)胞淋巴瘤消退、患者B細(xì)胞前體消除。CARs介導(dǎo)的抗腫瘤免疫效應(yīng)是多種多樣的，構(gòu)建更穩(wěn)定表達(dá)、更能持續(xù)增殖、更高靶分子親合力、更強(qiáng)細(xì)胞裂解活性的CAR-T細(xì)胞是今后的努力方向。

3 CARs在腫瘤免疫治療中的臨床研究

3.1 臨床試驗(yàn) 盡管當(dāng)前針對(duì)腫瘤等疾病開(kāi)發(fā)的CAR-T種類(lèi)多樣（圖2），然而這種免疫治療法從實(shí)驗(yàn)室走向臨床研究歷經(jīng)波折。1994年Roberts等［8］首次將CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，以CAR-T細(xì)胞成功殺傷人類(lèi)免疫缺陷病毒感染的CD4＋T細(xì)胞。而CAR-T的臨床應(yīng)用卻沒(méi)有這么順利，CARs的首次臨床應(yīng)用結(jié)果是由Lamers等［9］在2006年公布的，以靶向碳酸酐酶Ⅸ的CAR-T細(xì)胞治療3例轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者并未觀(guān)察到預(yù)期的臨床效應(yīng)。直到2008年這種免疫療法才獲得了真正意義上令人興奮的臨床研究結(jié)果，在以非洲淋巴細(xì)胞病毒特異性T細(xì)胞治療的11例兒童成神經(jīng)細(xì)胞瘤中，有6例取得了腫瘤灶變小和壞死的成效［10］。2011年美國(guó)某研究小組以二代CD19-CAR-T細(xì)胞靶向治療了3例慢性淋巴細(xì)胞白血病，盡管伴隨有淋巴細(xì)胞減少癥的發(fā)生，但是CAR-T細(xì)胞在患者血和骨髓中持續(xù)了6個(gè)月的高水平表達(dá)，其中有2例病情達(dá)到完全緩解的程度［5］。2013年Grupp等［11］發(fā)表了一篇針對(duì)急性淋巴性白血病的案例，以抗CD19＋的CAR-T細(xì)胞治療2例兒童；其中，1例在11個(gè)月中病情均表現(xiàn)為完全緩解；另1例患者則在緩解了2個(gè)月后復(fù)發(fā)，并且體內(nèi)爆發(fā)了大量的不表達(dá)CD19的癌細(xì)胞，其中的原因值得人們深思。

表1 嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞的臨床應(yīng)用

3.2 面臨的問(wèn)題

3.3.1 “脫靶效應(yīng)”（off-target effects） 越來(lái)越多的臨床試驗(yàn)暴露出CAR-T細(xì)胞的安全問(wèn)題。大多數(shù)靶抗原在正常組織中也會(huì)有少量的表達(dá)，CAR-T細(xì)胞與這類(lèi)抗原起反應(yīng)而引起組織損傷，即為“脫靶效應(yīng)”。2006年Lamers等［19］應(yīng)用靶向G25O抗原的CAR-T細(xì)胞治療腎細(xì)胞癌，正常G25O＋膽管細(xì)胞受到損傷，有3例發(fā)生了2～4級(jí)的肝臟毒性，經(jīng)皮質(zhì)類(lèi)固醇藥物治療后肝臟毒性減輕，這是首次報(bào)道的嵌合抗原受體淋巴細(xì)胞療法引起的脫靶效應(yīng)。最近，研究人員應(yīng)用第三代靶向HER2／neu的CART淋巴細(xì)胞治療1例晚期直腸癌患者致患者死亡［20］。該患者在靜脈輸注1010表達(dá)HER2／neu的CAR-T細(xì)胞15 min后開(kāi)始呼吸窘迫，40 min后肺部水腫，隨時(shí)間進(jìn)行性加重，在給予心臟復(fù)蘇、氣管插管及提升血壓處理后治療無(wú)效死亡。推測(cè)由于肺、肝臟等正常組織均表達(dá)HER2／neu抗原，高劑量的CAR-T細(xì)胞引起了脫靶效應(yīng)，導(dǎo)致患者多器官衰竭而死。

3.3.2 細(xì)胞因子風(fēng)暴 第二、三代CARs中引入了單或雙共刺激分子，信號(hào)泄漏或T細(xì)胞激活閾值的降低可能造成炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-γ等大量釋放入血，進(jìn)而引起以急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能衰竭為主的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。例如在上述Morgan研究組的直腸癌患者死亡的案例中，肺臟水腫及隨后引起的多器官衰竭即與大量細(xì)胞因子的釋放有關(guān)，級(jí)聯(lián)性的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”最終造成了患者的死亡［20］。

3.3 解決方法 2010年美國(guó)重組DNA咨詢(xún)委員會(huì)針對(duì)CAR-T細(xì)胞臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)的安全問(wèn)題提出了幾點(diǎn)建議［21］：第一，引入自殺基因的人工調(diào)控開(kāi)關(guān)，發(fā)生相關(guān)的毒性反應(yīng)時(shí)通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染自殺基因的T細(xì)胞凋亡而減輕毒性反應(yīng)；第二，嚴(yán)格按Ⅰ期臨床試驗(yàn)進(jìn)行治療，從低劑量的T細(xì)胞數(shù)目開(kāi)始輸注，防止速發(fā)的細(xì)胞毒性；第三，構(gòu)建雙靶抗原CARs，提高腫瘤靶向性；第四，在應(yīng)用第二、三代CAR-T細(xì)胞治療時(shí)應(yīng)不使用或謹(jǐn)慎使用IL-2，降低潛在細(xì)胞毒性；第五，通過(guò)低劑量多次輸注CARs修飾中樞記憶T細(xì)胞和干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞可建立免疫記憶的潛能、增加抗腫瘤特異性和減少對(duì)健康組織的損傷。

4 展望

1989年至今，嵌合抗原受體的腫瘤免疫治療方法已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，由第一代發(fā)展到雙信號(hào)和三信號(hào)的第二、三代，具有更好的免疫活性、更高的增殖率和更長(zhǎng)的存活時(shí)間。越來(lái)越多的研究人員正投入到對(duì)嵌合抗原受體腫瘤免疫治療方法的完善和拓展當(dāng)中，前期Ⅰ／Ⅱ期臨床研究取得的成果顯示著這項(xiàng)技術(shù)的巨大潛力。相信通過(guò)不斷摸索優(yōu)化更安全有效的臨床治療策略，克服其不良反應(yīng)將會(huì)使得這一過(guò)繼性免疫療法煥發(fā)出更璀璨的光芒。

［1］Kuwana Y，Askauar Y，Utsonmiya N，et al.Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V regions and T-cell receptor-derived C regions［J］.Biochem Biophys Res Common，1987，149（3）：960-968.

［2］Kochenderfer JN，Rosenberg SA.Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors［J］.Nat Rev Clin Oncol，2013，10（5）：267-276.

［3］Lanitis E，Poussin M，Hagemann IS，et al.Redirected antitumor activity of primary human lymphocytes transduced with a fully human anti-mesothelin chimeric receptor［J］. Mol Ther，2012，20（3）：633-643.

［4］Cheadle EJ，Sheard V，Hombach AA，et al.Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy［J］.Methods Mol Biol，2012，907：645-666.

［5］Porter DL，Levine BL，Kalos M，et al.Chimeric antigen receptor modified T cells in chronic lymphoid leukemia［J］. N Engl JMed，2011，365（8）：725-733.

［6］Logan TF，GoodingWE，Whiteside TL，et al.Biological response modulation by tumor necrosis factor alpha（TNF alpha）in a phase Ib trial in cancer patients［J］.Immunother，1997，20（5）：387-398.

［7］Kochenderfer JN，Wilson WH，Janik JE，et al.Eradication of Blineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19［J］.Blood，2010，116（20）：4099-4102.

［8］Roberts MR，Qin L，ZhangD，et al.Targeting of human immunodeficiency virus-infected cells by CD8＋T lymphocytes armed with universal T-cell receptors［J］.Blood，1994，84（9）：2878-2889.

［9］Lamers CH，Sleijfer S，Vulto AG，et al.Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydraseⅨ：first clinical experience［J］.Clin Oncol，2006，24（13）：20-22.

［10］Pule MA，Savoldo B，Myers GD，et al.Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors：persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma［J］.NatMed，2008，14（11）：1264-1270.

［11］Grupp SA，Kalos M，Barrett D，et al.Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia［J］.N Engl JMed，2013，368（16）：1509-1518.

［12］Em tage PC，Lo AS，Gomes EM，et al.Second-generation anti-carcinoembryonic antigen designer T cells resist activation-induced cell death，proliferate on tumor contact，secrete cytokines，and exhibit superior antitumor activity in vivo：a preclinical evaluation［J］.Clin Cancer Res，2008，14（24）：8112-8122.

［13］Kochenderfer JN，Dudley ME，F(xiàn)eldman SA，et al.B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine associated toxicity in a clinical trialofanti-CD19 chimeric-antigen receptor-transduced T cells［J］.Blood，2012，119（12）：2709-2720.

［14］Scholler J，Brady TL，Binder-Scholl G，et al.Decade-long safety and function of retroviral-modified chimeric antigen receptor T cells［J］.Sci Transl Med，2012，4（132）：132ra53.

［15］Saha S，Nakazawa Y，Huye LE，et al.piggyBac transposon system modification of primary human T cells［J］.J Vis Exp，2012（69）：e4235.

［16］Till BG，Jensen MC，Wang J，etal.CD20-specific adoptive immunotherapy for lymphoma using a chimeric antigen receptor with both CD28 and4-1BBdomains：pilot clinical trial results［J］.Blood，2012，119（17）：3940-3950.

［17］Maiti SN，Huls H，Singh H，et al.Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications［J］.J Immunother，2013，36（2）：112-123.

［18］Hillerdal V，Ramachandran M，Leja J，etal.Systemic treatment with CAR-engineered T cells against PSCA delays subcutaneous tumor growth and prolongs survival ofmice［J］.BMC Cancer，2014，14：30.

［19］Lamers CH，Langeveld SC，Groot-van Ruijven CM，et al. Gene-modified T cells for adoptive immunotherapy of renal cell cancer maintain transgene-specific immune functions in vivo［J］.Cancer Immunol Immunother，2007，56（12）：1875-1883.

［20］Morgan RA，Yang JC，kitano M，etal.Case reportof a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2［J］.Mol Ther，2010，18（4）：843-851.

［21］Ertl HC，Zaia J，Rosenberg SA，etal.Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells：observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held June 15，2010［J］.Cancer Res，2011，71（9）：3175-3181.

Chimeric antigen receptor for immunotherapy of cancer

WU Yuting，LIANG Huasheng
（Cellular and Molecular Clinical Medicine Research Center of Wu Jieping Medical Foundation，Beihai People′s Hospital，Beihai Guangxi 536000，China；）

Down-regulating the necessary component of immune system and suppressing production of immunosuppressive factors results in the tumor immune escape.Recently，the genetic modification of T cellswith chimeric antigen receptors（CARs）was designed to solve themechanism of escape immunosurveillance.The unique structure of CARs endows T cell tumor specific cytotoxicity and tumor antigen recognition ability.This adoptive antitumor immunotherapy develops rapidly and brings hope to the patients with tumors.

Chimeric antigen receptors（CARs）；Adoptive immunotherapy

R730.51

A

2095-3097（2014）02-0108-04

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.02.012

2014-02-17 本文編輯：馮 博）

第十四批（2011年度）廣西“新世紀(jì)十百千人才工程”第二層次人選專(zhuān)項(xiàng)資金資助

536000廣西北海，北海市人民醫(yī)院吳階平醫(yī)學(xué)基金會(huì)細(xì)胞與分子臨床醫(yī)學(xué)研究中心（伍玉婷，梁華晟）