裴明日 姜 麗

吉林市食品藥品檢驗所，吉林 吉林 132001

甲醛水楊酸涂劑微生物限度檢查方法研究

裴明日 姜 麗

吉林市食品藥品檢驗所，吉林 吉林 132001

目的建立甲醛水楊酸涂劑的微生物限度檢查方法。方法采用平皿法及控制菌檢查方法。結(jié)果細(xì)菌數(shù)測定可采用培養(yǎng)基稀釋法（0．2 ml/皿），霉菌、酵母菌數(shù)的測定可采用培養(yǎng)基稀釋法（0．2 ml/皿），控制菌檢查金黃色葡萄球菌可采用培養(yǎng)基稀釋法（取1:10供試液10 ml加入1000 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中）、銅綠假單胞菌可采用培養(yǎng)基稀釋法（取1:10供試液10 ml加入1000 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中）。結(jié)論經(jīng)多次試驗方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于該制劑的微生物限度檢查。

培養(yǎng)基稀釋法；甲醛水楊酸涂劑；抑菌；菌液；回收率

甲醛水楊酸涂劑是由甲醛溶液、水楊酸、樟腦、乙醇等與水混合制成，具有減少汗腺分泌、止癢、抑菌、用于多汗癥、汗皰疹、腋臭癥等。為了能有效地控制藥品質(zhì)量，進(jìn)行微生物限度檢查方法驗證試驗。

1 儀器、培養(yǎng)基與菌種

1.1 儀器

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱；MJX-250B-Z型霉菌培養(yǎng)箱；202-2型電熱干燥箱；YXQ-LS-50S1型高壓鍋；JA5002型電子天平（d=0.01 g）。

1.2 培養(yǎng)基

玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液均符合《中國藥典》2010年版二部附錄附錄Ⅺ J要求［1］。以上培養(yǎng)基均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]均符合《中國藥典》2010年版二部附錄附錄Ⅺ J要求。

1.4 供試品

甲醛水楊酸涂劑，解放軍空軍某醫(yī)院，批號20130814、130821、130805。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備與檢驗

取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物各1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，金黃色葡萄球菌稀釋至10-7，枯草芽孢桿菌10-7、大腸埃希菌稀釋至10-7，約為50～100 cfu/ml，銅綠假單胞菌稀釋至10-6，約為10～100 cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。取經(jīng)26℃

培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-6，約為50～100 cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。

取經(jīng)26℃培養(yǎng)1周的黑曲霉菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物，加5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸取出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-5，約為50～100 cfu/ml，做活菌計數(shù)備用［1］。

2.2 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.2.1 供試液制備取供試品10 ml，加入45℃pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，振蕩混勻，作為1∶10供試液。

2.2.2 回收率測定

2.2.2.1 試驗組（1）培養(yǎng)基稀釋法（0.5 ml）：取供試液原液1 ml，分別注入2個平皿中，每個平皿0.5 ml供試液和50～100 cfu試驗菌1 ml，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d逐日觀察結(jié)果，按平皿法測定其菌數(shù)；（2）培養(yǎng)基稀釋法（0.5 ml）：取1∶10供試液1 ml，分別注入2個平皿中，每個平皿0.5 ml供試液和50～100 cfu試驗菌1 ml，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d逐日觀察結(jié)果，按平皿法測定其菌數(shù)；（3）培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml）：取1∶10供試液1 ml，分別注入5個平皿中，每個平皿0.2 ml供試液和50～100 cfu試驗菌1 ml，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d逐日觀察結(jié)果，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.2.2.2 菌液組測定所加的試驗菌數(shù)。

2.2.2.3 供試品對照組取1∶10供試液，按培養(yǎng)基稀釋法的菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。

2.2.3 回收率的計算按如下公式計算試驗組的加菌回收率［2］

2.2.4 結(jié)果，見表1、表2、表3

2.3 控制菌檢查方法的驗證

2.3.1取供試品10 ml，加入45℃pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，振蕩混勻，作為1∶10供試液。

2.3.2 金黃色葡萄球菌

2.3.2.1 陽性對照試驗組（1）培養(yǎng)基稀釋法：取1∶10供試液10 ml及10～100 cfu金黃色葡萄球菌試驗菌液1 ml，加至300 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平

板上，培養(yǎng)72 h，觀察結(jié)果；（2）培養(yǎng)基稀釋法：取1∶10供試液10 ml及10～100 cfu金黃色葡萄球菌試驗菌液1 ml，加至500 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果；（3）培養(yǎng)基稀釋法：取1∶10供試液10 ml及10～100 cfu金黃色葡萄球菌試驗菌液1 ml，加至1000 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果。

表1 菌液組菌落計數(shù)結(jié)果（cfu/ml）

表2 試驗組菌落計數(shù)結(jié)果（cfu/ml）

表3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證加菌回收率結(jié)果（%）

2.3.2.2 供試品組取1∶10供試液10 ml加入1000 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)48 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果。

2.3.2.3 陽性對照組取10～100 cfu試驗菌1ml加入100 ml營養(yǎng)肉湯增菌液中，35℃培養(yǎng)48 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果。

2.3.2.4 陰性菌對照組取10～100 cfu大腸埃希菌1 ml加入100 ml營養(yǎng)肉湯增菌液中，35℃培養(yǎng)48 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果。

2.3.2.5 陰性對照組取稀釋液10 m加入100 ml營養(yǎng)肉湯增菌液中，35℃培養(yǎng)48 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果。

2.3.2.6結(jié)果，見表4

表4 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基稀釋法（3次結(jié)果）

2.3.3 銅綠假單胞菌

2.3.3.1 陽性對照試驗組（1）培養(yǎng)基稀釋法：取1∶10供試液10 ml及10～100 cfu銅綠假單胞菌試驗菌液1 ml，加至300 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果；（2）培養(yǎng)基稀釋法：取1∶10供試液10 ml及10～100 cfu銅綠假單胞菌試驗菌液1 ml，加至500 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果；（3）培養(yǎng)基稀釋法：取1∶10供試液10 ml及10～100 cfu銅綠假單胞菌試驗菌液1 ml，加至1000 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果。

2.3.3.2 供試品組取1∶10供試液10 ml加入1000 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果。

2.3.3.3 陽性對照組取10～100 cfu試驗菌1 ml加入100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果。

2.3.3.4 陰性菌對照組取10～100 cfu大腸埃希菌1ml加入100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果。

2.3.3.5 陰性對照組：取稀釋液10 ml加入100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h后按照“（1）”方法觀察結(jié)果。

2.3.3.6 結(jié)果，見表5

表5 銅綠假單胞菌培養(yǎng)基稀釋法（3次結(jié)果）

3 結(jié)論

我們按照《中國藥典》2010年版二部微生物限度檢查法培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml/皿）檢驗：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉等實驗菌的回收率均大于70%。按照《中國藥典》2010年版二部微生物限度檢查法控制菌的方法學(xué)驗證試驗，金黃色葡萄球菌可采用培養(yǎng)基稀釋法（取1∶10供試液10 ml加入1000 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中）、銅綠假單胞菌可采用培養(yǎng)基稀釋法（取1∶10供試液10 ml加入1000 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中）時，陽性菌生長良好，陰性菌均未檢出，表明該控制菌檢查方法的專屬性好，可用于控制菌檢查［3］。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部附錄）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：107.

［2］ 中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：351.

［3］ 李霞，董衛(wèi)紅，韓曼雪，等.新清寧片微生物限度檢查方法研究［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，16（9）：825-826.

The Method for Microbial Limit Tests of Formaldehyde and Salicylic Acid Paint

PEI Mingri JIANG Li Jilin Food and Drug Inspection Office，Jilin Jilin132001，China

ObjectiveEstablish formaldehyde salicylic acid coated method of microbial limit examination．MethodsThe AGAR method and the control bacteria checking method．ResultsOf bacteria culture medium dilution method can be used measuring （0．2 ml/melamine），can be used for determination of the number of mold and yeast culture medium dilution method （0．2 ml/dish）， check control bacteria staphylococcus aureus culture medium dilution method can be used （take "selected 10 ml to 1000 ml of liquid nutrient broth medium），pseudomonas aeruginosa， culture medium dilution method can be used （take 1:10 10 ml to 1000 ml lactose bile salts were fluid medium）．ConclusionThrough many times test method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the preparation of microbial limit examination．

Culture Medium Dilution Method，F(xiàn)ormaldehyde Salicylic Acid Coated，Bacteriostatic，Bacteria Liquid，Recovery

R927

B

1674-9316（2014）23-0078-03

10．3969/J．ISSN．1674-9316．2014．23．046