張慶慶，王燕燕，張文芳

（1.中國(guó)人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)系，北京100038；2.北京市公安局法醫(yī)鑒定中心，北京100192）

毛細(xì)管電泳在線富集技術(shù)在季銨鹽農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用

張慶慶1，王燕燕2，張文芳2

（1.中國(guó)人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)系，北京100038；2.北京市公安局法醫(yī)鑒定中心，北京100192）

季銨鹽類農(nóng)藥屬于極性強(qiáng)的堿性有機(jī)陽(yáng)離子化合物，用常規(guī)氣相色譜方法分析較困難，而高效毛細(xì)管電泳很適合分離季銨鹽這類離子化合物。由于進(jìn)樣量以及檢測(cè)器靈敏度的制約，毛細(xì)管電泳通常要使用在線富集技術(shù)提高其濃度檢測(cè)限。針對(duì)季銨鹽陽(yáng)離子的特性，具體探討了用毛細(xì)管電泳分析此類陽(yáng)離子化合物的幾種在線富集技術(shù)，也可為檢測(cè)其他類似分析物起到借鑒作用。

季銨鹽農(nóng)藥；毛細(xì)管電泳；陽(yáng)離子；在線富集

一、引言

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的季銨鹽農(nóng)藥有百草枯（PQ）、敵草快（DQ）、燕麥枯（DF）、甲哌啶（MQ）和矮壯素（CQ），屬中低毒類農(nóng)藥，都是極性強(qiáng)的易溶于水的堿性有機(jī)陽(yáng)離子化合物，易殘留，且易產(chǎn)生環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題。此類農(nóng)藥檢測(cè)方法有光譜法[1][2]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[3][4]、液相色譜紫外檢測(cè)法（LCUV）[5][6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[7][8]及酶聯(lián)免疫法（ELISA）[9][10]等。

用氣相色譜分析季銨鹽比較困難，需要用還原劑將其還原。目前主流的反相液相色譜分析，需在流動(dòng)相中添加離子對(duì)試劑增加其在柱上的保留性，但離子對(duì)試劑會(huì)影響質(zhì)譜的檢測(cè)靈敏度。近年來(lái)，雖然已研制出了無(wú)須添加離子對(duì)試劑的親水性色譜柱，但PQ和DQ峰仍難基線分離，影響色譜的準(zhǔn)確定量[11]。用毛細(xì)管電泳（CE）分離季銨鹽時(shí)，PQ和DQ則很容易就能基線分離，分離效率高、出峰快，很適合于分離檢測(cè)季銨鹽類極性化合物。但毛細(xì)管檢測(cè)光程短，檢測(cè)體積?。ㄖ挥幸合鄼z測(cè)池的1/100），最常配備的二極管陣列（PDA）檢測(cè)器的靈敏度（檢測(cè)限10-5～10-6mol/L）遠(yuǎn)不及激光誘導(dǎo)熒光（LIF）檢測(cè)器（檢測(cè)限10-14mol/L）[12]。而且MQ和CQ不含紫外生色團(tuán)，在使用紫外檢測(cè)器時(shí)，需用間接紫外檢測(cè)的方法，而間接檢測(cè)法本身的靈敏度不高[13]。CE-MS（毛細(xì)管-質(zhì)譜法）能解決定性的問(wèn)題，同時(shí)檢測(cè)五種季銨鹽，但已有的方法靈敏度不是很理想[14]。針對(duì)靈敏度低的問(wèn)題，在沒(méi)有高靈敏度檢測(cè)器的情況下，需考慮結(jié)合在線富集或離線預(yù)處理等方法提高靈敏度。而在線富集技術(shù)只需要調(diào)整背景緩沖液以及進(jìn)樣程序就能將靈敏度提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，極大地降低了濃度檢測(cè)限，因此被廣泛運(yùn)用于CE分析中。

能用于季銨鹽陽(yáng)離子檢測(cè)的毛細(xì)管電泳富集模式有：（1）毛細(xì)管區(qū)帶電泳（Capillaryzoneelectrophoresis，CZE）。包括場(chǎng)放大堆積（Field-amplifiedsample stacking，F(xiàn)ASS）；大體積堆積（Large-volume sample stacking，LVSS）；pH-修飾堆積（pH-mediated-stacking）。（2）膠束毛細(xì)管電動(dòng)色譜（Micellarelectrokinetic chromatography，MEKC）。包括常規(guī)的膠束電動(dòng)（Nor mal-stacking MEKC）；掃集-膠束電動(dòng)（Sweeing-M EKC）；陽(yáng)離子選擇性耗盡進(jìn)樣-掃集-膠束電動(dòng)（Cation-selective exhaustive injection-sweepin g-micellarelectrokinetic chromatography，CSEI-sweeping-MEK C）。（3）等速電泳（Isotachophoresis，ITP）。

二、毛細(xì)管區(qū)帶電泳富集

（一）場(chǎng)放大樣品堆積（FASS）

將樣品制備在低電導(dǎo)基質(zhì)中，毛細(xì)管經(jīng)背景電解質(zhì)溶液（BGS）平衡后，壓力引進(jìn)少量低電導(dǎo)溶液（通常是水），在毛細(xì)管進(jìn)樣端形成一個(gè)高電場(chǎng)的區(qū)域。電動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，分析物離子會(huì)很快通過(guò)低電導(dǎo)區(qū)域遷移到達(dá)樣品區(qū)帶和BGS的邊界，隨后因電場(chǎng)強(qiáng)度下降導(dǎo)致遷移速度變慢從而聚焦在邊界附近。FASS富集效果顯著，操作簡(jiǎn)單，但若沒(méi)有水柱，分析物離子容易堆積在頂端進(jìn)樣口處，造成富集效應(yīng)退化。

圖1 毛細(xì)管電泳場(chǎng)放大分離季銨鹽示意圖

季銨鹽在pH1～14的范圍內(nèi)幾乎都能完全電離，成為高度溶劑化、質(zhì)子化的陽(yáng)離子，而緩沖液pH值主要是影響毛細(xì)管壁硅羥基的電離進(jìn)而影響電滲流（EOF）大小。Galceran[15]等分析了pH值、溫度、電壓、緩沖陽(yáng)離子濃度、進(jìn)樣模式等人對(duì)遷移時(shí)間、表觀淌度、峰高等參數(shù)的影響。另外，在緩沖溶液中添加一定比例的乙腈能改善PQ和DQ間的分離度和基線穩(wěn)定性[16]。為改善重現(xiàn)性，有時(shí)采用兩端同時(shí)加壓來(lái)避免因焦耳熱產(chǎn)生的氣泡[17]。

（二）大體積堆積（LVSS）

圖2 毛細(xì)管電泳大體積進(jìn)樣分離季銨鹽示意圖

LVSS檢測(cè)季銨鹽時(shí)，需要加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等改性劑使電滲流逆轉(zhuǎn)。樣品溶解在低電導(dǎo)液中，毛細(xì)管充滿BGS后進(jìn)樣，常采取整管進(jìn)樣方式，將樣品溶液灌滿整根毛細(xì)管后，施加正向分離電壓。此時(shí)，電滲流朝向入口端，而陽(yáng)離子分析物則朝向出口檢測(cè)端遷移，堆積在樣品區(qū)帶和BGS邊界，陰離子和中性離子向入口端遷移，慢慢地退出毛細(xì)管。仔細(xì)監(jiān)測(cè)工作電流，直至上升接近原始值的95～99%后改變電壓方向進(jìn)行正常的電泳分離。變成負(fù)電壓后電滲流逆轉(zhuǎn)，推動(dòng)逆流的陽(yáng)離子向檢測(cè)端遷移。Nú?ez[18]結(jié)合固相萃取使用該富集方式檢測(cè)飲用水中三種季銨鹽除草劑。此外，LVSS也可以采用不改變電壓方向的方式進(jìn)行，但BGS的pH＜3，此時(shí)電滲流受到抑制[19]。LVSS方式不能同時(shí)分離檢測(cè)陰離子和陽(yáng)離子，更適用于檢測(cè)淌度不大的離子，且操作不容易控制。

（三）pH-修飾堆積（pH-mediated-stacking）

圖3 pH酸修飾富集分離季銨鹽示意圖

在FASS和LVSS中，為了實(shí)現(xiàn)富集，樣品采用水或者低電導(dǎo)緩沖液配制，而常見(jiàn)的生物樣本為電解質(zhì)溶液，離子強(qiáng)度大，需要繁瑣的前處理過(guò)程來(lái)進(jìn)行提取和凈化。pH-修飾富集是對(duì)高電導(dǎo)樣本采用酸堿中和作用的一種富集方法，即用酸或堿中和樣品中的高電導(dǎo)基質(zhì)，形成低電導(dǎo)區(qū)帶而堆積樣品。這種技術(shù)可用于分離富集低濃度、高離子強(qiáng)度的樣品，能避免由于樣品區(qū)帶的導(dǎo)電性高于背景電解質(zhì)而導(dǎo)致的去堆積現(xiàn)象[20]。在高離子強(qiáng)度基質(zhì)的樣品電動(dòng)進(jìn)樣后，再電動(dòng)進(jìn)樣一段強(qiáng)酸，強(qiáng)酸中的質(zhì)子在電動(dòng)進(jìn)樣時(shí)快速向樣品區(qū)帶遷移，中和其中的弱酸根離子，使樣品區(qū)帶變成電中性，電導(dǎo)率降低，促使待測(cè)物離子的遷移速度加快，堆積在邊界處。該方式目前還沒(méi)有人應(yīng)用于季銨鹽農(nóng)藥檢測(cè)中。

三、毛細(xì)管膠束電動(dòng)富集

（一）常規(guī)的膠束電動(dòng)（MEKC）

圖4 常規(guī)的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜堆積分離季銨鹽示意圖

CZE是基于溶質(zhì)淌度差異進(jìn)行分離的，而MEK C則是基于溶質(zhì)在膠束中的不同分配進(jìn)行分離的。將樣品制備于低電導(dǎo)的緩沖溶液中，背景緩沖液含有能形成膠束的SDS（十二烷基硫酸鈉），再將毛細(xì)管充滿緩沖液，注射樣品溶液之后，施加正向電壓以MEKC模式分離，分析物在含有膠束的緩沖液中遷移堆積[21]。

（二）掃集-膠束電動(dòng)（Sweeing-MEKC）

圖5 反向電壓掃集-膠束電動(dòng)分離季銨鹽示意圖

Sweeping-MEKC中所有溶液要保持低pH值抑制電滲流，制備樣品用的基體溶液與背景緩沖溶液的導(dǎo)電性基本相同，樣品溶液中不加固定相。BGS是含表面活性劑的膠束緩沖液，樣品可溶解在沒(méi)有膠束的緩沖液中，當(dāng)BGS和樣品溶液注入完成后，運(yùn)行負(fù)電壓，陰離子向入口端移動(dòng)，陽(yáng)離子向出口端移動(dòng)，SDS膠束進(jìn)入毛細(xì)管樣品溶液區(qū)帶掃集分析物。趙燕燕[22]在檢測(cè)血清中的PQ時(shí)，比較分析了Swee ping-MEKC與紫外分光光度這兩種測(cè)試方法。

（三）陽(yáng)離子選擇性耗盡進(jìn)樣-掃集-膠束電動(dòng)（CS EI-sweeping-MEKC）

圖6 陽(yáng)離子選擇性耗盡電動(dòng)分離季銨鹽示意圖

毛細(xì)管首先用不含膠束的BGS預(yù)處理，再引入高電導(dǎo)率的緩沖溶液（不含有機(jī)溶劑），隨后引進(jìn)一段水柱施加正向電壓電遷移進(jìn)樣（樣品制備在低電導(dǎo)率介質(zhì)中），之后將毛細(xì)管兩端置于含膠束的BGS下施加負(fù)電壓分離。該方法將掃集與場(chǎng)放大樣品技術(shù)聯(lián)用，先用電動(dòng)進(jìn)樣使樣品堆積，再用膠束掃集使樣品第二次富集，因此，能明顯地提高富集效果，方法選擇性強(qiáng)，適合樣品中痕量及超痕量組分的分離分析。因相反電荷分析物與SDS之間存在強(qiáng)烈的相互作用，CSEI-sweeping-MEKC在線陽(yáng)離子濃縮用陰離子SDS膠束能提供高的選擇性富集[23]。Nú?ez[21]比較了MEKC、Sweeping-MEKC、CSEI-Sweeping-M EKC這三種在線富集方式，結(jié)果Sweeping-MEKC的富集倍數(shù)是500倍，而CSEI-Sweeping-MEKC的富集倍數(shù)達(dá)到了5萬(wàn)倍，檢測(cè)限均小于1ug/ml。

四、毛細(xì)管等速電泳富集

圖7 毛細(xì)管等速電泳分離季銨鹽示意圖

用兩種淌度差別大的緩沖體系分別構(gòu)成前導(dǎo)離子（Leading ion）和尾隨離子（Terminating ion），將試樣像夾心餅干一樣夾在二者之間。因前導(dǎo)離子淌度最大，遷移最快，因而走在最前，其后是淌度次之的離子。所有溶質(zhì)都按前導(dǎo)離子的速度等速前移，并形成獨(dú)立的溶質(zhì)區(qū)帶而得到分離[24]。Kaniansky[25]和Walker[26]等人用該方法檢測(cè)過(guò)水樣中的PQ和DQ，但這種方式操作并不簡(jiǎn)便，檢測(cè)限也不理想，因此使用不多。

五、結(jié)論

比較以上幾種富集模式，其中FASS的富集效果好且操作簡(jiǎn)便；而CSEI-sweeping-MEKC的富集倍數(shù)最高，但操作較復(fù)雜；pH-修飾更適于生物高鹽樣本；LVSS能避免因離子淌度差異引起的進(jìn)樣歧視問(wèn)題。因此，實(shí)踐中可依據(jù)實(shí)際情況選擇適合的富集模式。應(yīng)用在線富集技術(shù)，無(wú)需對(duì)儀器進(jìn)行改造就能降低濃度的檢測(cè)限，大幅提高儀器的檢測(cè)靈敏度，使得CE技術(shù)在分析領(lǐng)域有了更廣闊的應(yīng)用。

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A

1673―2391(2014)08―0165―04

2014-07-15責(zé)任編校：江流

公安部科技強(qiáng)警基礎(chǔ)工作專項(xiàng)項(xiàng)目（編號(hào)：2013GABJC002）。