馬 萍，吳 誠，王景成，曹 淼，孫 平，張麗平，牛華英（.第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 00088；.濟(jì)南大成醫(yī)藥發(fā)展有限公司，山東 濟(jì)南 5000）

HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液中兩種組分的含量

馬 萍1，吳 誠1，王景成2，曹 淼1，孫 平2，張麗平1，牛華英2（1.第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100088；2.濟(jì)南大成醫(yī)藥發(fā)展有限公司，山東 濟(jì)南 250100）

目的：建立HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液中乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明的含量。方法：色譜柱為Luna氰基柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水-三乙胺（50∶50∶0.5）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長230 nm；進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果：乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明與二苯酮分離良好。乳酸依沙吖啶在0.601 2 ～ 1.403 0 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r = 0.999 4），鹽酸苯海拉明在0.148 7 ～ 0.346 9 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r = 0.999 9），依沙吖啶和苯海拉明的平均回收率分別為99.91%、99.73%，RSD分別為1.06%（n = 9）、1.10%（n = 9）。結(jié)論：本方法簡便準(zhǔn)確，快速可靠，可用于復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液的含量測(cè)定和質(zhì)量控制。

復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液；乳酸依沙吖啶；鹽酸苯海拉明；高效液相色譜法；含量測(cè)定

復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液（復(fù)方利凡諾溶液），是《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年版）中收載的外用滅菌溶液劑[1]。其有效組分為乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明，具有消炎、脫敏、止癢的作用，臨床上常用于治療皮膚濕疹等疾病。復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有乳酸依沙吖啶紫外檢測(cè)的含量測(cè)定方法，本文建立HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液中兩種組分的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（包括LC-10ATVP泵、SPD-10AVP紫外檢測(cè)器、PDA檢測(cè)器、LC Solution 色譜工作站，日本島津公司）。

乳酸依沙吖啶（中國藥品檢定研究院，含量：94.3%，批號(hào)100290-201002）；鹽酸苯海拉明（中國藥品檢定研究院，含量：99.9%，批號(hào)100066-200807）；復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液（100 mL/瓶，含乳酸依沙吖啶200 mg及鹽酸苯海拉明50 mg，第二炮兵總醫(yī)院配制科研用）；二苯酮（北京通縣育才精細(xì)化工廠，批號(hào)970721）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Luna氰基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-水-三乙胺（50∶50∶0.5，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至6.5）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長：230 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液分別精密稱取乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明對(duì)照品適量，分別置于量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度制成濃度為5.314 mg·mL-1和2.478 mg·mL-1儲(chǔ)備液；精密量取乳酸依沙吖啶儲(chǔ)備液2 mL和鹽酸苯海拉明儲(chǔ)備液1 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品溶液備用。

2.2.2 供試品溶液精密量取復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液5 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即為供試品溶液。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

精密稱取二苯酮5 mg，置于100 mL量瓶中，加乙腈5 mL使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻；另取乳酸依沙吖啶對(duì)照品10 mg和鹽酸苯海拉明對(duì)照品2.5 mg，置于同一10 mL量瓶中，加上述二苯酮溶液1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，即為定位溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按二苯酮、乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明的順序出峰，各峰之間的分離度均應(yīng)大于2.0，乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明的理論塔板數(shù)分別大于3000和5000。詳見圖1。

圖1 復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液典型HPLC圖A – 空白基質(zhì)溶液，B – 定位溶液（含5 μg·mL-1的二苯酮和1000 μg·mL-1的乳酸依沙吖啶及250 μg·mL-1的鹽酸苯海拉明），C – 供試品溶液，D – 對(duì)照品溶液；1 – 二苯酮，2 – 乳酸依沙吖啶，3 – 鹽酸苯海拉明Fig 1 Typical HPLC chromatograms of complex ethacridine lactate solutionA – blank substrate solution, B – locating solution( 5 μg·mL-1diphenyl ketone, 1000 μg·mL-1ethacridine lactate and 250 μg·mL-1benzhydramine hydrochloride), C – sample solution, D –reference solution; 1 – diphenyl ketone, 2 – ethacridine lactate, 3 –benzhydramine hydrochloride

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取乳酸依沙吖啶儲(chǔ)備液1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL和鹽酸苯海拉明儲(chǔ)備液0.6、0.8、l.0、1.2、1.4 mL分別置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻，各取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別以濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明的回歸方程分別為：Y = 1.77×107X – 5.78×105（r = 0.999 4）、Y = 1.56×107X – 2.54×104（r = 0.999 9）。結(jié)果表明，乳酸依沙吖啶（0.601 2 ～ 1.403 0 mg·mL-1）和鹽酸苯海拉明（0.148 7 ～ 0.346 9 mg·mL-1）在各自濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算，測(cè)得乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明的RSD分別為0.13%和0.16%（n = 6），表明方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明色譜峰面積RSD分別為0.06%和0.15%（n = 5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液（批號(hào)090915）共6份，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明的平均標(biāo)示量（%）分別為101.12%（RSD = 0.98%）、100.52%（RSD = 0.75 %），RSD均小于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

取乳酸依沙吖啶對(duì)照品約40、50、60 mg（含量94.3%），各3份，精密稱定，分別置9個(gè)50 mL量瓶中，按處方比例各加入鹽酸苯海拉明對(duì)照品約10、12.5、15 mg各3份，加水適量使溶解，并用水稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明對(duì)照品，精密稱定，用水溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含乳酸依沙吖啶1 mg與鹽酸苯海拉明0.25 mg的溶液，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品中乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明的回收率。乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明的平均回收率分別為99.91%、99.73%，RSD分別為1.06%、1.10%。具體見表1和表2。

2.9 耐用性實(shí)驗(yàn)

分別改變流動(dòng)相中有機(jī)相比例（±5%）、流動(dòng)相pH值（± 0.1）、柱溫（27 ℃、33 ℃）與流速（0.98 mL·min-1、1.02 mL·min-1），以“2.3”項(xiàng)下定位溶液為供試品溶液，在上述不同的條件下分別取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察各峰之間的分離度。詳見表3。

表1 乳酸依沙吖啶回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 9Tab 1 Results of recovery test for ethacridine lactate. n = 9

表2 鹽酸苯海拉明回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 9Tab 2 Results of recovery test for benzhydramine hydrochloride. n = 9

表3 耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of durability test

結(jié)果顯示微調(diào)有機(jī)相比例（± 5%），pH值（± 0.1），柱溫（27 ～ 33 ℃），流速（0.98 ～ 1.02 mL·min-1），系統(tǒng)適用性溶液中各峰之間的分離度均大于2.0，表明方法耐用性良好。

2.10 樣品含量測(cè)定

取復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液3批，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明的含量，詳見表4。

表4 復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液的含量測(cè)定結(jié)果.%Tab 4 Results of contents determination in complex ethacridine lactate solution. %

3 討論

有關(guān)乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明各自的含量測(cè)定方法文獻(xiàn)[2-3]均有報(bào)道，但同時(shí)檢測(cè)的方法未見報(bào)道。因此，本文建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定制劑中乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明的含量。

《中國藥典》（2010年版）[4]分別收載了乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明HPLC的含量測(cè)定方法，由于乳酸依沙吖啶有2個(gè)芳香胺基結(jié)構(gòu)，C18對(duì)其保留強(qiáng)，因此采用C18色譜柱，而鹽酸苯海拉明則采用氰基鍵合硅膠為填充劑。本實(shí)驗(yàn)首先嘗試采用《中國藥典》中乳酸依沙吖啶的HPLC法，但通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在該條件下鹽酸苯海拉明峰形差、嚴(yán)重拖尾、理論塔板數(shù)低，繼而嘗試采用《中國藥典》中鹽酸苯海拉明的HPLC法，用氰基鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水-三乙胺（50∶50∶0.5，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5）為流動(dòng)相，該條件下乳酸依沙吖啶和苯海拉明保留時(shí)間適合，峰形對(duì)稱，分離度好。

乳酸依沙吖啶在270 nm波長處有最大吸收，鹽酸苯海拉明在258 nm波長處有最大吸收，如果以270 nm或258 nm為檢測(cè)波長，兩者峰面積相差懸殊，為了便于定量，選擇兩者吸收較相近的230 nm為檢測(cè)波長。由純度實(shí)驗(yàn)可見，乳酸依沙吖啶和鹽酸苯海拉明的峰純度均符合規(guī)定，兩主峰處均未檢出其他雜質(zhì)，表明本方法專屬性良好。經(jīng)方法學(xué)考察，本文建立的檢測(cè)方法操作簡便、重現(xiàn)性佳、回收率高，可作為復(fù)方乳酸依沙吖啶溶液含量測(cè)定和質(zhì)量控制方法。

[1]中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部.中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范[S].2002年版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2003：112.

[2]劉玉春，李艷娜.HPLC法測(cè)定乳酸依沙吖啶注射液的含量[J].安徽醫(yī)藥，2008，12（3）：225-226.

[3]江燕.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸苯海拉明片的有關(guān)物質(zhì)和溶出度[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2006，23（4）：331-333.

[4] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：481，725.

Simultaneous determination of two components in complex ethacridine lactate solution by HPLC

MA Ping1, WU Cheng1, WANG Jing-cheng2, CAO Miao1, SUN Ping2, ZHANG Li-ping1, NIU Hua-ying2(1. Department of Pharmacy, General Hospital of the Rocket Forces , Beijing 100088, China; 2. Jinan Dachpharm Development Co. Ltd., Jinan 250100, China)

Objective:To establish the HPLC method for simultaneous determination of ethacridine lactate and benzhydramine hydrochloride in complex ethacridine lactate solution.Methods:The extract was separated by Luna CN column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm ), and the mobile phase was consisted of acetonitrile-water-triethylamine (50 : 50 : 0.5) with the fl ow rate of 1.0 mL·min-1. The column temperature was 30 ℃. The detection wavelength was 230 nm and the injection volume was 20 μL.Results:The calibration curves of ethacridine lactate and benzhydramine hydrochloride were linear in the range of 0.601 2 – 1.403 0 mg·mL-1(r = 0.999 4) and 0.148 7 – 0.346 9 mg· mL-1(r = 0.999 9), respectively. The average recovery of ethacridine lactate was 99.91% with RSD of 1.06% (n = 9). The average recovery of benzhydramine hydrochloride was 99.73% with RSD of 1.10% (n = 9).Conclusion:The method is simple, accurate and reliable. It can be used as the quality control of complex ethacridine lactate solution.

Complex ethacridine lactate solution; Ethacridine lactate; Benzhydramine hydrochloride; HPLC; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2014)03 – 0149 – 03

2014-01-20

2014-03-03）

軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)課題計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（13ZJZ22）

牛華英，女，副主任藥師，主要從事新藥研發(fā)工作。E-mail：niuhuaying@sohu.com

馬萍，女，副主任藥師，主要從事醫(yī)院新制劑研發(fā)及藥物臨床研究。E-mail：maping691009@126.com