張 宏，張 琴，劉澤源，徐亞飛，曲恒燕（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院，北京 100071）

·實(shí)驗(yàn)研究·

TAT-tCNTF對CD損傷細(xì)胞的作用機(jī)制研究

張 宏，張 琴，劉澤源，徐亞飛，曲恒燕（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院，北京 100071）

目的：探討TAT-tCNTF對細(xì)胞松弛素D（CD）導(dǎo)致的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVECs）損傷的作用機(jī)制。方法：TAT-tCNTF處理經(jīng)CD損傷的細(xì)胞，CCK-8法檢測其對細(xì)胞活力的影響；熒光顯微鏡觀察羅丹明-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的F-actin的變化；熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞內(nèi)Fluo 4-AM標(biāo)記的Ca2+濃度變化；Western blot檢測F-actin蛋白水平變化。結(jié)果：10 μmol·L-1CD降低HUVECs的細(xì)胞活動(dòng)度（P ＜ 0.000 1），而10 μg·mL-1的TAT-tCNTF明顯升高HUVECs的細(xì)胞活動(dòng)度（P = 0.003）；熒光顯微鏡下觀察到CD作用后的細(xì)胞F-actin斷裂且分布減少，而TAT-tCNTF可改善這一現(xiàn)象；TAT-tCNTF可降低由CD引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載；FCM顯示CD組Ca2+熒光強(qiáng)度（MFI）較對照組增強(qiáng)，而（CD + TAT-tCNTF）組的MFI較CD組減弱。Western blot結(jié)果顯示各組F-actin表達(dá)量無明顯差異。結(jié)論：TAT-tCNTF對CD引起的細(xì)胞損傷有改善作用，其機(jī)制與維持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和緩解細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)。

TAT-tCNTF；細(xì)胞松弛素D；F-actin；Ca2+超載

睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）支持營養(yǎng)神經(jīng)元并修復(fù)受損的神經(jīng)元[1-2]，增加肌纖維細(xì)胞的數(shù)量[3]。但其本身透膜能力較差，難以通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能。人類免疫缺陷病毒-1的反義激活轉(zhuǎn)錄（trans-activator transcription，TAT）蛋白片段是有效的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，能攜帶外源性蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞[4]。本實(shí)驗(yàn)室將TAT與截短式的CNTF（truncated CNTF）的基因序列進(jìn)行重組表達(dá)，獲得融合蛋白TAT-tCNTF。前期實(shí)驗(yàn)證明其活性與CNTF基本一致[5]，但TAT-tCNTF進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制并不清楚。TAT主要是以巨胞飲方式穿過細(xì)胞膜[6]，故采用巨胞飲抑制劑CD研究TAT-tCNTF的透膜機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)著重研究CD對細(xì)胞活力、構(gòu)成微絲的纖維狀肌動(dòng)蛋白（ fi lamentous actin，F(xiàn)-actin）及支撐其運(yùn)動(dòng)的Ca2+的變化，進(jìn)而考察TAT-tCNTF對CD所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 儀器

iMark全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），熒光顯微鏡-Axio Observer A1（德國Zeiss公司），流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）。

1.2 藥物與試劑

TAT-tCNTF（本實(shí)驗(yàn)室制備），細(xì)胞松弛素D（Calbiochem公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司），CCK-8試劑（日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所），羅丹明-鬼筆環(huán)肽（Cytoskeleton公司），DAPI（MP公司），F(xiàn)luo 4-AM（日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所），F(xiàn)-actin抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），GAPDH抗體（Sigma公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，隔天傳代。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞活動(dòng)度

總的來說，教學(xué)內(nèi)容的實(shí)踐也是小學(xué)數(shù)學(xué)教學(xué)中一大重點(diǎn)板塊之一，對于提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和學(xué)習(xí)積極性都有著十分重要的正面影響作用，需要在實(shí)際教學(xué)過程中給予重視。

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以5×105個(gè)·mL-1的懸液種植于96孔板。實(shí)驗(yàn)分組為對照組、CD組、CD+TAT-tCNTF組和TAT-tCNTF組，并設(shè)立空白組。細(xì)胞加入10 μmol·L-1的CD孵育30 min，洗滌之后加入10 μg·mL-1的TAT-tCNTF孵育24 h。加入CCK-8溶液孵育2 h，在450 nm波長處測定吸光度值（A450）。細(xì)胞活動(dòng)度 = A450（試驗(yàn)組-空白組）/A450（對照組-空白組）×100%。

1.6 羅丹明-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記觀察F-actin

將種植于24孔板的HUVECs經(jīng)CD和TAT-tCNTF同前處理后，去除培養(yǎng)基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5% Triton X-100滲透細(xì)胞，PBS清洗，每孔加入100 nmol·L-1的羅丹明-鬼筆環(huán)肽工作液，室溫避光孵育30 min。PBS清洗，用1 μg·mL-1的DAPI工作液孵育30 s后，熒光顯微鏡下拍照，羅丹明用綠光激發(fā)，DAPI用紫光激發(fā)。

1.7 Fluo 4-AM標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化情況

將種植于6孔板的HUVECs經(jīng)CD和TAT-tCNTF同上處理后，除盡培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入5 μmol·L-1的Fluo 4-AM工作液，37 ℃孵育30 min，陰性對照采用PBS代替。除去工作液，PBS洗滌，加入PBS覆蓋細(xì)胞，37 ℃孵育20 min。熒光顯微鏡下觀察拍照；另將其消化離心收集于流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長為494 nm，發(fā)射光波長為516 nm。

1.8 Western blot檢測F-actin的蛋白表達(dá)水平

將藥物處理后的HUVECs提取蛋白，同時(shí)將蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后并轉(zhuǎn)膜，加兔源F-actin一抗（1∶300）4 ℃孵育過夜，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶7000）室溫孵育2 h，然后于暗室加入ECL化學(xué)發(fā)光液，X膠片顯影、定影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TAT-tCNTF改善CD對HUVECs的生長抑制

CD降低HUVECs的細(xì)胞活動(dòng)度（P ＜ 0.000 1），而TAT-tCNTF可明顯升高CD作用后的HUVECs的細(xì)胞活動(dòng)度（P = 0.003）。詳見圖1。

圖1 HUVECs細(xì)胞活動(dòng)度的變化.n= 6A – 對照組，B – CD（10 μmol·L-1）組，C – CD（10 μmol·L-1） + TAT-tCNTF（10 μg·mL-1）組，D – TAT-tCNTF（10 μg·mL-1）組注：與A組比較，**P ＜ 0.000 1；與B組比較，##P = 0.003Fig 1 Variation of the cell viability of HUVECs.n= 6A – control group, B – CD (10 μmol·L-1) group, C – CD (10 μmol·L-1) + TAT-tCNTF (10 μg·mL-1) group, D – TAT-tCNTF (10 μg·mL-1) groupNote: compared with group A,**P ＜ 0.000 1; compared with group B,##P = 0.003

2.2 TAT-tCNTF穩(wěn)定F-actin結(jié)構(gòu)

羅丹明-鬼筆環(huán)肽將F-actin直接熒光染色，呈紅色；DAPI將細(xì)胞核染成藍(lán)色。如圖2所示，經(jīng)CD作用后F-actin相對于對照組減少，其細(xì)胞微絲斷裂；而經(jīng)TAT-tCNTF處理受損細(xì)胞后，F(xiàn)-actin的纖維絲連接相對較緊密。

圖2 CD和TAT-tCNTF對F-actin的影響（×40）A – 對照組，B – CD（10 μmol·L-1）組，C – CD（10 μmol·L-1）+ TAT-tCNTF（10 μg·mL-1）組，D – TAT-tCNTF（10 μg·mL-1）組Fig 2 Effect of CD and TAT-tCNTF on F-actin (×40)A – control group, B – CD (10 μmol·L-1) group, C – CD (10 μmol·L-1) + TAT-tCNTF (10 μg·mL-1) group, D – TAT-tCNTF (10 μg·mL-1) group

2.3 TAT-tCNTF緩解CD引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載

熒光顯微鏡下觀察到Fluo 4-AM將Ca2+染成綠色。相對于對照組，經(jīng)CD作用后的細(xì)胞，胞內(nèi)綠色熒光明顯增加，表明細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度較高；而再經(jīng)TAT-tCNTF處理的細(xì)胞綠色熒光相對減少。詳見圖3。

圖3 Fluo 4-AM標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的顯微觀察（×10）A – 對照組，B – CD（10 μmol·L-1）組，C – CD（10 μmol·L-1）+TAT-tCNTF（10 μg·mL-1）組，D – TAT-tCNTF（10 μg·mL-1）組Fig 3 Microscopic observation of intracellular Ca2+labeled by Fluo 4-AM staining (×10)A – control group, B – CD (10 μmol·L-1) group, C – CD (10 μmol·L-1) + TAT-tCNTF (10 μg·mL-1) group, D – TAT-tCNTF (10 μg·mL-1) group

流式細(xì)胞術(shù)檢測Ca2+染色的平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescene intensity，MFI）。相對于對照組（MFI為440），CD組（MFI為539）的MFI增加，說明其細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度較高；而CD + TAT-tCNTF組的MFI為499，較CD組降低，表明TAT-tCNTF能夠降低CD引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加。詳見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Fluo 4-AM標(biāo)記的Ca2+的熒光強(qiáng)度A – 對照組，B – CD（10 μmol·L-1）組，C – CD（10 μmol·L-1）+ TAT-tCNTF（10 μg·mL-1）組，D – TAT-tCNTF（10 μg·mL-1）組Fig 4 MFI of Fluo 4-AM labeled intracellular Ca2+by flow cytometryA – control group, B – CD (10 μmol·L-1) group, C – CD (10 μmol·L-1) + TAT-tCNTF (10 μg·mL-1) group, D – TAT-tCNTF (10 μg·mL-1) group

2.4 F-actin蛋白表達(dá)量基本不改變

F-actin蛋白表達(dá)量如圖5示，在內(nèi)參GAPDH表達(dá)基本一致的基礎(chǔ)上，CD組與其他組的F-actin蛋白表達(dá)量無明顯差異。

圖5 F-actin蛋白表達(dá)量A – 對照組，B – CD（10 μmol·L-1）組，C – CD（10 μmol·L-1）+ TAT-tCNTF（10 μg·mL-1）組，D – TAT-tCNTF（10 μg·mL-1）組Fig 5 Expression of F-actin proteinA – control group, B – CD (10 μmol·L-1) group, C – CD (10 μmol·L-1) + TAT-tCNTF (10 μg·mL-1) group, D – TAT-tCNTF (10 μg·mL-1) group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室制備的可穿膜重組TAT-tCNTF，在前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其與CNTF的藥理作用相似，甚至在一些活性方面超過CNTF[5]。這可能由于重組的TAT-tCNTF的通透性增強(qiáng)，使TAT-tCNTF與CNTFα受體結(jié)合更加充分，從而發(fā)揮更好的藥理作用，如通過抗氧化作用保護(hù)神經(jīng)元[7]。

CD結(jié)合于actin和F-actin的生長端，從而阻抑肌動(dòng)蛋白的聚合，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白解聚[8]，本實(shí)驗(yàn)采用TAT-tCNTF對CD損傷細(xì)胞進(jìn)行了作用機(jī)制研究。CD可抑制細(xì)胞的增長，這與CD切斷微絲，抑制細(xì)胞的分裂一致[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)TAT-tCNTF作用后細(xì)胞活動(dòng)度明顯增加，說明TAT-tCNTF能夠從增加細(xì)胞活力上緩解CD所致的細(xì)胞損傷，也證實(shí)TAT-tCNTF促進(jìn)細(xì)胞的增長，不僅發(fā)生在神經(jīng)元細(xì)胞，也發(fā)生在非神經(jīng)元細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽直接標(biāo)記F-actin，結(jié)果顯示經(jīng)CD作用后細(xì)胞的F-actin明顯斷裂且分布減少；而給予TAT-tCNTF后，F(xiàn)-actin分布和形態(tài)基本得以恢復(fù)。說明TAT-tCNTF能夠調(diào)節(jié)F-actin來維持細(xì)胞的微絲結(jié)構(gòu)。

采用Fluo 4-AM熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的Ca2+，結(jié)果表明CD可使細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度增加，跟以往報(bào)道一致[10]，說明CD使F-actin結(jié)合的Ca2+釋放，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載；而TAT-tCNTF可緩解由CD所致的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。另外，各組處理方式不影響F-actin表達(dá)量，說明CD只切斷微絲，不引起微絲解聚。以上結(jié)果表明TAT-tCNTF在一定程度上穩(wěn)定F-actin，即能固定和支持微絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)中CD降低細(xì)胞活力并破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，而TAT-tCNTF對細(xì)胞活力和細(xì)胞骨架有明顯的改善修復(fù)作用，說明TAT-tCNTF對CD損傷的細(xì)胞具有緩解作用。其機(jī)制可能與TAT-tCNTF促進(jìn)細(xì)胞生長、維持F-actin的形成和修復(fù)、維持細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)等有關(guān)。該結(jié)果為研究TAT-tCNTF的藥理作用以及藥物透膜機(jī)制提供了新的思路，由于通過基因工程構(gòu)建的TAT-tCNTF的藥理作用及作用機(jī)理較為復(fù)雜，仍需進(jìn)一步的研究證明。

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Studies of the mechanism of TAT-tCNTF on cell injury caused by cytochalasin D

ZHANG Hong, ZHANG Qin, LIU Ze-yuan, XU Ya-fei, QU Heng-yan(Af fi liated Hospital of Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China)

Objective:To investigate the mechanism of TAT-tCNTF on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injured by cytochalasin D (CD).Methods:After HUVECs were treated with CD and TAT-tCNTF, cell viability was determined by CCK-8. The structural changes of F-actin stained by rhodamine labeled ghost cyclic peptide were observed through the fl uorescence microscope. Concentrations of intracellular free calcium by Fluo 4-AM loading were detected through the fl uorescence microscope and fl ow cytometry. Western blot was used to detect the expression of F-actin protein.Results:CD (10 μmol·L-1) reduced the cell viability of HUVECs (P ＜ 0.000 1), while TAT-tCNTF (10 μg·mL-1) significantly increased the cell viability of HUVECs (P = 0.003). F-actin with CD was fractured and reduced, while it was improved after subsequent treatment with TAT-tCNTF. TAT-tCNTF alleviated the calcium overload caused by CD. Flow cytometry showed mean fl uorescence intensity (MFI) of Ca2+in CD group was stronger than that in control group, the MFI of Ca2+in (CD + TAT-tCNTF) group was lower than that in CD group. Western blot showed the expression of F-actin protein had almost no change among all groups.Conclusion:TAT-tCNTF ameliorated the cell injury caused by CD. The mechanism was associated with maintaining actin cytoskeleton and alleviating the calcium overload.

TAT-tCNTF; Cytochalasin D; F-actin; Calcium overload

R965

A

1672 – 8157(2014)03 – 0145 – 04

2013-09-03

2014-01-07）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81001438）

曲恒燕，女，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥理學(xué)。E-mail：quhymail@126.com

張宏，男，碩士，研究方向：生物醫(yī)學(xué)工程。E-mail：13601192278@126.com