（農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（成都）四川省飼料工作總站，四川成都610041）

霉菌毒素是霉菌的次生代謝產(chǎn)物，是霉菌生長(zhǎng)所導(dǎo)致的一個(gè)重要結(jié)果。部分霉菌毒素毒性強(qiáng)，致病能力強(qiáng)，危害大。長(zhǎng)期以來(lái)人們錯(cuò)誤地認(rèn)為霉菌毒素問(wèn)題多見(jiàn)于南方梅雨季節(jié)或夏季高溫高濕時(shí)間。而最近幾年的研究表明，霉菌毒素對(duì)動(dòng)物的危害是全國(guó)性、全年性的，霉菌可以在不同地區(qū)、不同溫度范圍內(nèi)繁殖產(chǎn)生。以霉菌毒素中最常見(jiàn)的黃曲霉毒素為例，黃曲霉毒素屬于遺傳毒性致癌物(致DNA損傷)，也是目前發(fā)現(xiàn)的化學(xué)致癌物中最強(qiáng)的物質(zhì)之一。1993年，世界衛(wèi)生組織和國(guó)際癌癥研究所將黃曲霉毒素確定為一級(jí)人類致癌物。飼料中霉菌毒素對(duì)人體的危害由此可見(jiàn)，建立一種經(jīng)濟(jì)、快捷、準(zhǔn)確度和靈敏度高的檢測(cè)方法很有必要。與應(yīng)永飛等的霉菌毒素檢測(cè)方法相比,本文建立的我國(guó)有限量標(biāo)準(zhǔn)的幾種霉菌毒素檢測(cè)方法有以下創(chuàng)新點(diǎn)：①采用新開(kāi)發(fā)的MycoSpin?400多功能柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，減少了分析過(guò)程中對(duì)目標(biāo)物的干擾。②同時(shí)檢測(cè)5種霉菌毒素，所有我國(guó)現(xiàn)在飼料中有限量標(biāo)準(zhǔn)的霉菌毒素均可以同時(shí)檢測(cè)。③正、負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間和成本，提高了檢測(cè)效率。④采用13C內(nèi)標(biāo)定量，幾種我國(guó)有限量標(biāo)準(zhǔn)的霉菌毒素均采用自己的同位素內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)結(jié)果更加科學(xué)、準(zhǔn)確。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

液質(zhì)聯(lián)用儀配有電噴霧源(美國(guó)Aglient 1290/6460)；電子天平(0.01 mg，德國(guó)賽多利斯公司);渦旋振蕩器（禾本森科有限公司）；電動(dòng)振蕩器（美國(guó)LKA-werke公司）；高速冷凍離心機(jī)（Biofug PrimoR公司）；N-EVAP氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）。

乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司）；乙酸、乙酸銨（優(yōu)級(jí)純，天津科密歐化學(xué)試劑公司）；MycoSpin?400多功能凈化柱(美國(guó)Romer公司)；黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混標(biāo)：1.0 μg/ml(美國(guó)Romer公司);嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素混標(biāo)：10 μg/ml(美國(guó)Romer公司)；赭曲霉毒素A:10 μg/ml(美國(guó)Romer公司)。黃曲霉毒素B1([13C17]-aflatoxin B1)、嘔吐毒素([13C15]-deoxynivalenol)、玉米赤霉烯酮([13C18]-zearale?none)、T-2毒素([13C24]-T-2 toxin)和赭曲霉毒素A([13C20]-ochratoxin A)同位素內(nèi)標(biāo)(美國(guó)Romer公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水機(jī)(美國(guó)MILLPORE公司)純化的超純水。

1.2 色譜和質(zhì)譜條件

Thermo BDS HYPERSIL C18色譜柱（2.1 mm×100 mm,2.4 μm,美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：5 μl；流速：300 μl/min；流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

離子源：電噴霧離子源；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：正模式4 000 V，負(fù)模式3 500 V；干燥氣溫度：350℃;干燥氣流量：13 L/min；霧化氣壓力40 psi；掃描方式、監(jiān)測(cè)離子對(duì)(m/z)和其他參考條件參見(jiàn)表2。

名稱嘔吐毒素[13C15]-deoxynivalenol黃曲霉毒素G2黃曲霉毒素G1黃曲霉毒素B2黃曲霉毒素B1[13C17]-aflatoxin B1赭曲霉毒素A[13C20]-ochratoxin A T-2毒素[13C24]-T-2 toxin玉米赤霉烯酮[13C18]-zearalenone保留時(shí)間(min)2.11 2.11 3.88 4.13 4.36 4.59 4.59 5.58 5.58 5.98 5.98 6.36 6.36母離子(Fm)297.1（85）312.2(88)331.0(100)329.1(140)315.1(110)313.1(130)330.1(140)404.0(109)424.1(108)484.3(94)508.1(84)317.1(148)335.2(152)定量離子(CE)249.1（6）263.2(4)313.1(25)243.1(29)287.1(29)285.1(21)301.2(19)239.0(21)250.1(19)305.2(3)322.3(3)175.2(21)290.3(11)定性離子(CE)203.1（14）285.1(29)283.0(25)259.1(29)241.1(40)358.1(9)185.2(12)131.2(25)

1.3 溶液配制

準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，用10 mM乙酸銨-甲醇(8：2，V/V)稀釋，配制成100、80、50、20、10和5 ng/ml混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于冰箱中2~8℃保存，有效期3個(gè)月。提取液：乙腈：水(84：16,V/V)。

1.4 樣品處理步驟

準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎過(guò)40目篩，0.45 mm孔徑的飼料樣品5 g試樣(精確至0.001 g)于50 ml離心管中，加入25 ml提取液（84/16，乙腈/水溶液），再加入0.25 ml乙酸，渦旋均質(zhì)3 min或者振蕩90 min，過(guò)濾上清液，或10 000 r/min離心5 min，將1 ml過(guò)濾后的上清液和適當(dāng)內(nèi)標(biāo)液加入MycoSpin?400凈化柱中，蓋緊凈化柱，劇烈振蕩混合1 min，掰斷凈化柱底端，將凈化柱放入離心管中，以10 000 r/min離心3 min，蒸干500 μl上清液，用500 μl流動(dòng)相定容，過(guò)0.22 μm濾膜，上LCMS/MS檢測(cè)。

1.5 定性測(cè)定

進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，如果檢出的色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品相一致，所選擇的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)樣品的離子豐度比相一致，允許偏差小于±2.5%，則可判斷樣品中存在響應(yīng)的被測(cè)物。

1.6 定量測(cè)定

本方法采用內(nèi)標(biāo)法單離子定量測(cè)定，為減少基質(zhì)的影響。黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2以[13C17]-黃曲霉毒素B1為內(nèi)標(biāo)；T-2毒素以[13C24]-T-2毒素為內(nèi)標(biāo)；赭曲霉毒素A以[13C20]-赭曲霉毒素A為內(nèi)標(biāo)；玉米赤霉烯酮以[13C18]-玉米赤霉烯酮為內(nèi)標(biāo)；嘔吐毒素以[13C15]-嘔吐毒素為內(nèi)標(biāo)。采用單點(diǎn)或曲線方程進(jìn)行定量計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

目前，霉菌毒素的提取方法主要以甲醇、乙腈及它們與水的混合溶液為提取劑。本研究在此基礎(chǔ)上，比較了70%、84%(V/V)的乙腈-水溶液的提取效率，并對(duì)提取時(shí)間、提取方式等條件進(jìn)行了比較，玉米赤霉烯酮具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，其他幾種霉菌毒素的規(guī)律與玉米赤霉烯酮類似。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果的比較確定了最佳條件：84%乙腈-水溶液在振蕩90 min或均質(zhì)攪拌3 min時(shí)對(duì)各霉菌毒素的提取效果總體效果最佳。8種霉菌毒素的回收率均大于80%。

表3 玉米赤霉烯酮不同提取方式對(duì)回收率的影響(n=6)

2.2 凈化條件的選擇

固相萃取凈化方法是復(fù)雜基質(zhì)中痕量檢測(cè)進(jìn)行凈化的常用方法。本研究對(duì)Myco Sep@226型清洗柱和MycoSpin?400多功能凈化柱的凈化效果進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)表明，Myco Sep@226在凈化黃曲霉毒素時(shí)具有良好的凈化效果，回收率較穩(wěn)定，但玉米赤霉烯酮的回收率及穩(wěn)定性較差。采用MycoSpin?400多功能凈化柱得到了較為滿意的凈化效果，結(jié)果更加穩(wěn)定。具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。因此，本研究選擇Myco?Spin?400多功能凈化柱作為本方法的凈化柱。

表4 玉米赤霉烯酮不同凈化柱對(duì)回收率的影響(n=6)(%)

2.3 色譜柱的選擇

霉菌毒素結(jié)構(gòu)中多含有羧基和羥基，屬于中等極性化合物，易溶于乙腈和甲醇等極性溶劑，在一般的C18色譜柱上有較好的保留，本方法比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 mm×50 mm，1.7 μm、Agilent SB-C18 2.1 mm×50 mm，1.8 μm和Thermo BDS HYPERSIL C18 2.1 mm×100 mm,2.4 μm色譜柱，經(jīng)使用標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)各規(guī)格色譜柱進(jìn)樣分離得色譜質(zhì)譜圖。由試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，Thermo BDS HYPER?SIL C18 2.1×100 mm，2.4 μm色譜柱分離效果和靈敏度較好。標(biāo)準(zhǔn)液的選擇離子流圖見(jiàn)圖1。

2.4 流動(dòng)相的選擇

圖1 8種霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品的特征離子質(zhì)譜圖（MRM）

要實(shí)現(xiàn)8種霉菌霉毒素基線分離，并且達(dá)到歐盟對(duì)各種黃曲霉毒素的限量要求，必須選擇最為合適的流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)采用了甲醇-水和乙腈-水兩種常用的流動(dòng)相，為增加霉菌毒素的離子化效率，在水相中加入10 mmol/l的乙酸銨，經(jīng)比較大部分霉菌毒素使用甲醇的靈敏度要高于乙腈的，且分離度也比乙腈的要高。能夠在最短的時(shí)間內(nèi)得到很好的基線分離。最終確定用10 mM乙酸銨和甲醇做流動(dòng)相。

2.5 內(nèi)標(biāo)添加時(shí)間的選擇

根據(jù)樣品的提取效率，在乙腈+水（84+16）充分提取下，提取效率均高于90%，在考慮內(nèi)標(biāo)成本較高，選擇過(guò)柱前加內(nèi)標(biāo)。

2.6 方法的性能檢驗(yàn)

不同種類霉菌毒素在MRM方式下的靈敏度除取決于毒素本身的結(jié)構(gòu)原因外，主要與離子化的效率有關(guān)。將特定濃度的霉菌毒素加入到空白樣品中，然后按本方法樣品預(yù)處理方法進(jìn)行。經(jīng)進(jìn)樣分離檢測(cè)，所得定量限均滿足歐盟規(guī)定。曲線方程、檢出限和定量限見(jiàn)表5。

表5 各種霉菌毒素的線性關(guān)系和檢出限

2.7 方法的回收率及精密度

為了考察方法的準(zhǔn)確度，我們對(duì)豬配合飼料、濃縮飼料和玉米樣品進(jìn)行了回收率試驗(yàn)，采用不同水平的添加量，每個(gè)水平平行測(cè)定6份。平均回收率在80%~100%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，表明方法準(zhǔn)確度、精密度良好。具體結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 8種霉菌毒素平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.8 樣品的測(cè)定

為了進(jìn)一步考察本方法及儀器的準(zhǔn)確度，我們對(duì)禽配合飼料、濃縮飼料和玉米樣品進(jìn)行了與免疫親和柱方法的比較試驗(yàn)。對(duì)篩選出的含有霉菌毒素的樣品，同時(shí)進(jìn)行了本方法與免疫親和柱方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7。由結(jié)果可知，該方法與免疫親和柱方法結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最大為8.66%，進(jìn)一步表明方法準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論

本文采用乙腈/水(84/16)混合溶劑為提取液,經(jīng)MycoSpin?400凈化柱凈化，內(nèi)標(biāo)法定量，平均回收率在80%~100%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。方法定量限（LOQ）范圍在1.0~40 μg/kg之間。方法前處理簡(jiǎn)便、快速，靈敏度、準(zhǔn)確度高。能夠適用于飼料及飼料原料中5種霉菌毒素的檢測(cè)。