韓麗娟

（山東省青州市畜牧局，青州 262500）

肉用綿羊超數(shù)排卵技術(shù)研究

韓麗娟

（山東省青州市畜牧局，青州 262500）

目前，綿羊超數(shù)排卵及胚胎移植技術(shù)因各種因素的影響，應(yīng)用效果還不是很穩(wěn)定。試驗通過對4個品種的供體羊全部采用國產(chǎn)的FSH進(jìn)行超數(shù)排卵處理并進(jìn)行胚胎移植，探討在低成本情況下適合生產(chǎn)實踐應(yīng)用的超數(shù)排卵技術(shù)。對供體羊進(jìn)行3項試驗，所有供體羊均埋植CⅠDR 13 d進(jìn)行同期發(fā)情處理。試驗1，用總劑量為210ⅠU的FSH對無角陶賽特羊、白頭薩福克羊和特克塞爾羊3個品種的育成羊進(jìn)行超排處理。超排程序：在撤栓前48 h開始按遞減劑量肌肉注射FSH，12 h/次，共連續(xù)注射6次，在注射第4針FSH的同時肌肉注射氯前列烯醇0.1 mg。撤栓24 h后開始定時試情，連續(xù)試情3 d。供體在第一次出現(xiàn)發(fā)情的同時肌肉注射HCG 500ⅠU并采用本交或人工輸精的方式配種。供體發(fā)情開始后的第6天（發(fā)情當(dāng)天記為第0天）進(jìn)行手術(shù)法子宮角沖卵，沖出的胚胎在1 h內(nèi)移植入受體體內(nèi)。試驗2，用總劑量為240ⅠU的FSH對東弗里生羊、無角陶賽特羊、白頭薩福克羊和特克塞爾羊4個品種的成母羊進(jìn)行超數(shù)排卵處理。其余各處理程序與試驗1相同。試驗3，對無角陶賽特羊，根據(jù)其體重不同分別給予總劑量為210、225、240、255ⅠU的FSH超排處理。其余各處理程序與試驗1、2相同。結(jié)果表明：①210ⅠU FSH處理育成羊的超數(shù)排卵結(jié)果在無角陶賽特羊、白頭薩?？搜蚝吞乜巳麪栄蜷g無顯著差異（P＞0.05）。②240ⅠU FSH處理成母羊的超數(shù)排卵效果差異較大：東弗里生供體羊的胚胎可用率、卵回收率及卵受精率顯著高于無角陶賽特羊、白頭薩?？搜蚝吞乜巳麪栄颍≒＜0.05）。③FSH總劑量與體重比（ⅠU/kg）在3.4～4.6范圍內(nèi)3組間差異不顯著（P＞0.05），在3組間以3.4～4.0組的超排效果較好，差異不顯著（P＞0.05）。

綿羊；超數(shù)排卵；胚胎移植

超數(shù)排卵（superovulation）是指在母畜發(fā)情周期的適當(dāng)時間，施以外源促性腺激素，提高血液中促性腺激素的濃度，使卵巢中在自然情況下閉鎖的卵泡數(shù)減少，從而使較多的卵泡發(fā)育并排卵，簡稱“超排”。是快速繁育優(yōu)質(zhì)種羊的有效途徑。

1 材料

1.1 試驗動物及時間

供體羊共70只：育成羊18只，其中無角陶賽特羊6只、白頭薩?？搜?只、特克塞爾羊5只；成母羊52只，其中東弗里生羊5只、無角陶賽特羊31只、白頭薩?？搜?0只、特克塞爾羊6只。這些母羊均膘情良好、發(fā)情正常、健康無繁殖疾病。

飼養(yǎng)方式：為全年半放牧半舍飼的方式，試驗期間以舍飼為主。精料組成：豆餅10%+玉米25%+食鹽0.3%+預(yù)混料2.7%。

本試驗在2008年10—11月份進(jìn)行。

1.2 藥品

釋放型陰道海綿栓：自制；CIDR：新西蘭哈密爾頓生物公司；孕馬血清促性腺激素（PMSG）：1 000 IU/支，寧波市激素制品有限公司；垂體促卵泡素（FSH）：100IU/支，寧波市激素制品有限公司；氯前列烯醇（cloporostenol）：0.2 mg/支，寧波市激素制品有限公司；促排卵素3號（LHRH-A3）：20 IU/支，寧波市激素制品有限公司；絨毛膜促性腺激素（HCG）：100 IU/支，寧波市激素制品有限公司；沖卵液：1 000 mL/袋，ICPbio Limited，Auckland，NewZealand；酒精、碘酒、生理鹽水、雙蒸水、新潔爾滅、青霉素、鏈霉素等。

1.3 儀器與設(shè)備

Motic SMZ-140體視顯微鏡、Motic SMZ-140體視顯微鏡：麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司制造；手術(shù)移植活動保定車8臺：自制；MICROLIGHT150型雙穿刺腹腔鏡：澳大利亞產(chǎn)；移植針：澳大利亞Castell公司提供；常用手術(shù)等器械：國產(chǎn)；二通式?jīng)_胚導(dǎo)管：澳大利亞Castell公司提供。

2 方法

2.1 供體羊超排處理及配種

2.1.1 超排用促性腺激素及超排處理方法 超數(shù)排卵處理方法：供體均采用新西蘭CIDR陰道分叉栓一次性埋植13 d同期發(fā)情，撤栓前48 h根據(jù)個體體重分別給予總劑量為255 IU（體重71 kg以上）、240 IU（體重61～70 kg）、225 IU（體重51～60 kg）、210 IU（體重45～50 kg）的FSH進(jìn)行超數(shù)排卵處理，每間隔12 h肌肉注射一次，連續(xù)6次遞減注射，在注射第4次FSH的同時肌肉注射氯前列烯醇0.10 mg/只，發(fā)情同時肌肉注射HCG500 IU/只。

2.1.2 供體羊發(fā)情鑒定及配種 所有供體羊均于CIDR栓撤出后24 h開始用性欲旺盛的試情公羊進(jìn)行早晚試情，每次試情時間不少于60 min，連續(xù)試情3 d。供體羊發(fā)情后立即用種公羊直接本交或結(jié)合人工輸精，之后每12小時人工輸精一次，直至發(fā)情結(jié)束。

2.2 沖卵

以發(fā)情開始的第1天記為0 d，所有供體均于發(fā)情后第7天用手術(shù)法經(jīng)子宮回收胚胎。術(shù)前24 h將供體單獨圈養(yǎng)，停飼，空腹。手術(shù)器械等用0.15%的新潔爾滅溶液浸泡30 min進(jìn)行常規(guī)消毒。

術(shù)前將供體羊保定于手術(shù)移植車上，對供體進(jìn)行全身麻醉，術(shù)部剪毛消毒。手術(shù)時取頭低仰臥體位45～60°斜倒立保定法。手術(shù)部位于乳房下3～4 cm腹中線處，以常規(guī)方法消毒、切口打開腹腔，借助腹腔鏡與子宮鉗翻動卵巢系膜，觀察卵巢反應(yīng)及黃體情況并做記錄。對卵巢有反應(yīng)的供體用子宮鉗輕輕緩慢地將子宮角牽引到腹腔外，在一側(cè)子宮角基部用鈍鉗刺透子宮壁，插入沖卵導(dǎo)管，向沖卵管中打適量氣體，直到?jīng)_卵管的氣囊膨脹到適宜的程度可以保證沖卵液順利回流，在宮管結(jié)合部插入套管針，抽出針芯，并由此向子宮腔內(nèi)緩慢注入沖卵液。方法：先緩慢注入沖卵液20～25 mL，再補注入空氣5～10 mL，保證胚胎全部回收。用培養(yǎng)皿接收回流沖卵液，最后用手指輕輕壓擠子宮角，使沖卵液盡量回收完全，然后將沖卵管氣囊放氣，子宮角創(chuàng)口縫合。相同方法沖另一側(cè)子宮角，之后將子宮送回腹腔，用生理鹽水沖洗子宮。對手術(shù)部位進(jìn)行常規(guī)手術(shù)縫合、消毒。術(shù)后注射青霉素160萬IU，鏈霉素100萬IU，同時肌肉注射氯前列烯醇0.1 mg，以消除供體的黃體，保證供體在下一情期提早發(fā)情。

所回收的沖卵液立即送入21～26℃的無菌室，并在實體鏡下檢查吸取合格的胚胎，評定質(zhì)量，此時的受精卵在正常發(fā)育時應(yīng)處于桑椹胚至囊胚階段。對形態(tài)正常的胚胎在1 h內(nèi)移入卵巢上黃體發(fā)育較好的受體羊子宮角內(nèi)。將胚胎分為A、B、C、D四個等級進(jìn)行鑒定，其標(biāo)準(zhǔn)是：

A級胚胎：胚胎的形態(tài)正常，發(fā)育速度與胚胎日齡一致，卵裂球排列緊密適度，大小、色澤均勻，透明帶完整。

B級胚胎：發(fā)育速度與胚胎日齡基本一致，卵裂球排列不太緊密輪廓清晰，個別分裂球大，透明帶完整。

C級胚胎：分裂球排列松散輪廓不清晰，色澤過暗，有的破裂呈沙粒樣，有碎片；透明帶不完整等。

D級胚胎：變性胚、退化胚。

A、B級胚胎為可移植胚胎，C級胚胎常用于與A、B級胚胎搭配移植或直接舍棄，D級胚胎直接舍棄。分別將每只羊左右兩側(cè)卵巢上的黃體數(shù)、胚胎的發(fā)育階段、采胚數(shù)、可用胚數(shù)、變性胚數(shù)等作詳細(xì)記錄。

2.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 所有供體超數(shù)排卵結(jié)果

本試驗共超數(shù)排卵處理70只供體。其中有1只成母羊沒有發(fā)情表現(xiàn)，另有4只供體羊卵巢上沒有黃體只有卵泡，這5只供體羊沒有手術(shù)沖胚，其余65只均進(jìn)行手術(shù)沖卵，超排反應(yīng)率為92.86%（65/70）。所得平均黃體數(shù)8.65個（562/65），只均獲卵數(shù)4.88（317/65）枚，獲卵率為56.41%（317/562），只均獲可用胚數(shù)3.49（227/65）枚，卵可用率為71.61%（227/317），回收卵受精率為77.29%（245/317）。

3.2 不同藥物劑量超排結(jié)果

3.2.1 育成羊用210 IUFSH處理結(jié)果 試驗1，用總劑量為210 IU寧波產(chǎn)的FSH對無角陶賽特羊（6）、白頭薩?？搜颍?）、特克塞爾羊（5）共18只育成供體羊進(jìn)行超數(shù)排卵處理。18只供體羊全部發(fā)情，但手術(shù)觀察時發(fā)現(xiàn)有3只供體（Do、Su和Tx各1只）卵巢上沒有一級黃體只有未排卵卵泡，因此未沖卵，其余15只供體都進(jìn)行了手術(shù)沖卵。沖卵結(jié)果如下表1所示。

由表1及圖1可以看出，用210 IU寧波產(chǎn)FSH處理的3個品種間僅在卵回收率上Do顯著低于Su（P＜0.05），極顯著低于Tx（P＜0.01），而Su與Tx之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。卵巢上平均黃體數(shù)、可用胚數(shù)、受精卵率在三者之間均沒有差異（P＞0.05）；但Do的平均黃體數(shù)高于Su及Tx（6.25）；Tx在卵受精率、平均可用胚數(shù)、平均卵回收數(shù)均高于Su和Do；Do的胚胎存活率則高于Su和Tx。

表1 用210 IU FSH對不同品種育成綿羊超數(shù)排卵處理結(jié)果

圖1 210 IU FSH的卵回收率、受精率及胚胎可用率的比較

3.2.2 成母羊用240 IUFSH處理結(jié)果 試驗2，用總劑量為240 IU寧波產(chǎn)FSH對東弗里生羊（5）、無角陶賽特羊（13）、白頭薩?？搜颍?0）、特克塞爾羊（6）共34只成母羊進(jìn)行超數(shù)排卵處理。34只供體羊全部發(fā)情，但手術(shù)觀察時發(fā)現(xiàn)有2只供體（Su和Tx各1只）卵巢上沒有黃體或只有少數(shù)退化黃體及未排卵卵泡，因此未繼續(xù)沖卵，其余32只供體都進(jìn)行了手術(shù)沖卵。沖卵結(jié)果如下表2所示。

表2 用240 IU FSH對不同品種供體羊超數(shù)排卵處理結(jié)果

由表2及圖2可見，在胚胎可利用率方面，Os與Do、Tx間差異顯著（P＜0.05），而與Su（54.67%）間差異極顯著（P＜0.01）；Do、Su、Tx三者之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。在卵回收率方面：Su與Do、Tx間差異極顯著（P＜0.01）；Su與Os間差異顯著（P＜0.05）；Do與Os、Tx間沒有顯著性差異（P＞0.05）。在卵受精率方面：Os（93.48%）與Do（65.08%）、Su（66.67%）、Tx（66.67%）間均差異極顯著（P＜0.01）；Do、Su、Tx三者之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 240 IU FSH的卵回收率、受精率及胚胎可用率的比較

3.3 藥物劑量與體重比對超排效果的影響

試驗3，對18只無角陶賽特供體羊（Do）根據(jù)體重分別給予不同劑量的FSH藥物進(jìn)行超數(shù)排卵處理。給藥方法：在撤栓前48h根據(jù)個體體重分別給予總劑量為255IU（體重71 kg以上）、240 IU（體重61～70 kg）、225 IU（體重51～60 kg）、210 IU(體重45～50 kg)的FSH進(jìn)行超數(shù)排卵處理，然后依據(jù)FSH劑量與體重的比值（IU/kg）分為3.4～4.0（第1組）、4.0～4.3（第2組）和4.3～4.6（第3組）3個組別。處理結(jié)果如表3。

從表3的數(shù)據(jù)可見，體重與FSH的比值（IU/kg）從3.4～4.6的范圍內(nèi)對供體超排處理后的平均黃體數(shù)、卵泡數(shù)、卵回收率及可用胚數(shù)3方面均無顯著性差異（P＞0.05），F(xiàn)SH劑量與體重比值在3.4～4.0范圍內(nèi)（第1組）時的平均卵回收數(shù)、平均可用胚數(shù)、平均受精卵數(shù)都高于4.0～4.3組（第2組）和4.3～4.6（第3組）組，但差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 無角陶賽特供體羊FSH劑量與體重比值對超排效果的影響

4 討論

4.1 促性腺激素劑量對超排效果的影響

促性腺激素的使用劑量、種類、生產(chǎn)廠家及批號的不同都會影響到超數(shù)排卵的效果。常用的有澳大利亞、新西蘭及加拿大等國生產(chǎn)的激素制品及國內(nèi)寧波和中科院等單位的產(chǎn)品。據(jù)研究者報道，進(jìn)口激素的超數(shù)排卵效果要好于國產(chǎn)激素。如亓美玉［1］用新西蘭產(chǎn)FSH與寧波產(chǎn)的FSH對72只德國肉用美利奴羊進(jìn)行超排處理，試驗表明，回收卵受精率及可用胚率兩者間差異極顯著（P＜0.01）。

不同地區(qū)不同研究者用寧波產(chǎn)的FSH因所用劑量差異較大而超排結(jié)果也有一定的波動。余文莉等［2］在內(nèi)蒙古地區(qū)用寧波產(chǎn)FSH對綿羊進(jìn)行超排時發(fā)現(xiàn)，各品種FSH總劑量均在150 IU上下浮動，適宜范圍為120～180IU。張居農(nóng)等［3］用寧波產(chǎn)FSH 300 IU取得了較好的效果。張鎖林等［4］認(rèn)為，F(xiàn)SH劑量為240 IU時的超排效果最好,可用胚平均數(shù)為26.2枚。宋慶偉等［5］用寧波產(chǎn)FSH128～145 IU對不同品種的肉用綿羊進(jìn)行超排處理，獲得平均可用胚6.23枚（691/111），可用胚率62.03%（691/1114）。王峰等［6］用寧波產(chǎn)FSH 120 IU處理供體波爾山羊獲得可用胚數(shù)13.00枚±1.08枚。白喜云等［7］報道，寧波FSH劑量在280 IU以上時則卵巢上的卵泡數(shù)與黃體數(shù)在一定程度上呈正比例增加，但退化及未受精胚胎比率高達(dá)29.7%。劑量過小則起不到超數(shù)排卵的作用。其原因可能是每個超排處理的個體都有自身的生理環(huán)境，不同超排方案中各種措施及藥物間的綜合作用以及超排處理過程中各地區(qū)的氣候、光照等環(huán)境條件所引起的供體羊生殖內(nèi)分泌的不同及其對外源激素的敏感度不同。

在本試驗中用不同劑量的FSH對供體羊進(jìn)行超排處理結(jié)果變異較大，成母羊的平均卵回收數(shù)要高于育成羊，說明成母羊更適宜進(jìn)行超數(shù)排卵處理，育成羊最好不用于超數(shù)排卵。

4.2 供體品種對超排效果的影響

不同品種的個體其繁殖能力不同。Fernie等［8］的試驗結(jié)果表明，薩?？搜蚺c特克塞爾羊超排時的平均黃體數(shù)分別為9.5個±0.63個和8.4個±0.65個，二者間差異不顯著（P＞0.05）。張秀陶等［9］對相同時間不同品種綿羊的超排結(jié)果進(jìn)行比較，得出黃體數(shù)和只均可用胚數(shù)依次為白頭薩福克羊（10.8個、7.5枚）、東弗里生羊（10.8個、3.6枚）、陶賽特羊（9.2個、4.3枚）、特克塞爾羊（8.8個、3.5枚）。說明不同品種的供體對激素的反應(yīng)變化不明顯。

4.3 體重對超數(shù)排卵的影響

有研究表明，動物體重范圍與所需藥物的劑量范圍有一定的相關(guān)性。對體重較小的供體，使用激素劑量過大時其卵巢反應(yīng)強(qiáng)烈,發(fā)育的卵泡以及未排卵卵泡顯著增多;對體重較大的供體,卵巢發(fā)育的卵泡較少,激素劑量過小則排卵卵泡明顯減少。因此,一般體重大的動物應(yīng)適當(dāng)增加激素的劑量。高志英等［10］用120 IU寧波產(chǎn)FSH對德國肉用美利奴羊、無角陶賽特羊、特克塞爾羊3個品種的羊進(jìn)行超排處理，得出不同體重之間黃體數(shù)、回收胚胎數(shù)差異不顯著（P＞0.05），但可用胚胎數(shù)以41～50 kg組和51～60 kg組為好，71～80 kg組為最差，差異顯著（P＜0.05）；胚胎可用率41～50 kg組顯著高于其他各組（P＜0.01），51～60 kg組和61～70 kg組胚胎可用率顯著高于71～80 kg組（P＜0.01），61～70 kg組胚胎可用率與71～80 kg組差異顯著（P＜0.05）。張鎖林等［4］的研究結(jié)果表明，在35～70 kg之間的不同體重羊進(jìn)行超排的效果差異不顯著（P＜0.05）。

本試驗根據(jù)不同超排個體體重的高低給予不同劑量的FSH，結(jié)果顯示3組間的平均黃體數(shù)、卵泡數(shù)、卵回收數(shù)及可用胚數(shù)間均無顯著差異（P＞0.05），但第1組的平均黃體數(shù)、卵回收數(shù)、可用胚數(shù)、可用胚率及卵回收率均高于其他兩組。本試驗結(jié)果表明，在供體羊的選擇與用藥劑量上，體重似乎不是很重要的參數(shù)，這可能是因為本試驗羊只的體重比較集中，所以都選擇了相似的劑量。但為了獲得較好的超排效果及減少對供體的刺激應(yīng)以小劑量FSH處理為宜。但從具體超排工作來看，常因不同超排個體體重差異較大應(yīng)根據(jù)不同體重的個體給予不同劑量的FSH以達(dá)到較好的超排效果。

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S826.3

A

2095-3887（2014）06-0023-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.06.006

2014-08-11

韓麗娟（1979-），女，畜牧師，研究生學(xué)歷。研究方向：動物遺傳育種與繁殖。