洪勉名綜述，陳建英審校（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東湛江524000）

間充質(zhì)干細(xì)胞來源膜微囊轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白減輕心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展

洪勉名綜述，陳建英審校（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東湛江524000）

間質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白；心肌缺血；心肌再灌注損傷；綜述

缺血性心臟病是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，尤其是心肌梗死發(fā)生后，心肌細(xì)胞數(shù)量減少，梗死區(qū)纖維組織增生，逐漸發(fā)生退行性左心室重塑，心功能下降，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭。傳統(tǒng)藥物、搭橋手術(shù)、導(dǎo)管介入治療等血運(yùn)重建在一定程度上改善了心肌缺血的癥狀，使心肌梗死患者的生存率有所提高。然而恢復(fù)血流灌注后出現(xiàn)心肌功能障礙和結(jié)構(gòu)損害，表現(xiàn)為致死性再灌注損傷、心肌頓抑、心律失常和能量代謝的改變，稱之為心肌缺血再灌注損傷（IRI）[1]，即MI/R。近年來，IRI成為患者從缺血后復(fù)流獲益的主要障礙。其機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為與再灌注后細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、氧自由基大量生成、微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞/血小板之間相互作用等[2]。目前，臨床上治療心肌IRI的主要藥物有自由基清除劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、Ca2+拮抗劑等，但效果皆不理想。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）治療心肌梗死近年來受到廣泛關(guān)注，并已獲得部分結(jié)果，令人鼓舞，有望彌補(bǔ)目前藥物治療、介入治療以及手術(shù)治療的不足，成為缺血性心臟病的治療策略之一。

1 MSC通過膜微囊（MVs）作用保護(hù)心臟

MSC是一種存在于骨髓、脂肪、肌肉等胚內(nèi)組織以及胎盤和臍帶等胚外組織的未分化多能細(xì)胞，在不同的誘導(dǎo)條件下可以分化為不同組織，具有自我更新的能力，MSC來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增，不存在免疫排斥，是目前較為理想的治療用干細(xì)胞[3]。體內(nèi)MSC主要存在于骨內(nèi)膜和微血管外膜，構(gòu)成血管周圍微環(huán)境，對(duì)其他細(xì)胞起著支持作用，在連接組織和骨組織的形成、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定方面發(fā)揮作用。MSC在體外培養(yǎng)過程中，形態(tài)、表型或是分化潛能上都不是均一的，主要由祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞組成，培養(yǎng)后MSC植入能力下降，體內(nèi)存活能力減低，現(xiàn)更趨于命名為間充質(zhì)基質(zhì)[4]。MSC移植后在短時(shí)間內(nèi)大量死亡，心肌內(nèi)直接注射，存活率僅為2%～5%，在缺血區(qū)存活的少量MSC產(chǎn)生了非?？捎^的治療效果，使梗死心肌面積縮小。這不可能是移植細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞的再生作用，更可能的機(jī)制是MSC的旁分泌作用，許多研究證實(shí)，MSC能分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子，MSC的條件培養(yǎng)基能起到與MSC移植類似的功能效應(yīng)[5]。Angoulvant等[6]在豬和小鼠的心肌IRI模型中，靜脈注射MSC條件培養(yǎng)基，在短短4 h內(nèi)，MSC條件培養(yǎng)基能減少M(fèi)I/R 50%～60%，心功能顯著改善。Lai等[7]對(duì)培養(yǎng)上清做分子量分餾法分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)心肌作用有效成分大于1 000×103，提示上清液中分泌物的大分子群體而非小分子蛋白起作用。通過超速離心分離出這些顆粒同樣能夠減輕小鼠心肌IRI模型的梗死面積。通過電鏡觀察和流式細(xì)胞技術(shù)鑒定這些具有膜磷脂包裹的顆粒正是來源于MSC的MVs。

許多細(xì)胞包括MSC在靜息或缺氧應(yīng)激、凋亡、剪切力等因素刺激下會(huì)以“出孢”的形式從細(xì)胞膜釋放MVs，MVs是一種大小為0.1～1.0滋m且具有雙層磷脂結(jié)構(gòu)的囊泡，最近的研究提示，MVs主要是作為一種細(xì)胞間生物信號(hào)和信息交換的載體，MVs的各種組分，包括膜表面受體、生物活性脂類，內(nèi)含的各種細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子等蛋白質(zhì)及mRNA、miRNA均可以發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)入其他細(xì)胞內(nèi)[8]。來源于MSC的MVs已被證實(shí)具有明確的組織再生修復(fù)作用以及潛在的免疫調(diào)節(jié)、調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分化等功能，Huang等[9]認(rèn)為，MSC改善損傷修復(fù)的機(jī)制大部分來源于其分泌的MVs作用。Kim等[10]通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了730種MSC來源的MVs蛋白。對(duì)這些蛋白進(jìn)行功能分析表明這些蛋白涉及細(xì)胞增殖、黏附、遷移和形態(tài)發(fā)生。

2 MVs通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)減輕IRI

Li等[11]通過分析心肌IRI蛋白組學(xué)改變發(fā)現(xiàn)，多種蛋白質(zhì)大量減少，這些蛋白大部分是作用于脂肪酸氧化、糖酵解、三羧酸循環(huán)等過程的關(guān)鍵酶。這些能量生成關(guān)鍵酶缺失進(jìn)一步加劇IRI起始由于缺氧導(dǎo)致的能量生成障礙。再灌注心肌另一個(gè)蛋白組學(xué)顯著改變是促凋亡蛋白的增加，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是引起急性心肌梗死的主要因素之一，阻斷凋亡信號(hào)通路能夠減輕IRI。蛋白組學(xué)的改變?cè)谠俟嘧p傷后至少持續(xù)60 min，在這個(gè)時(shí)間窗內(nèi)通過補(bǔ)償?shù)鞍踪|(zhì)學(xué)的改變或許可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的損傷。MVs是具有磷脂膜結(jié)構(gòu)的微囊泡，目前普遍認(rèn)為其通過傳遞其包含的物質(zhì)發(fā)揮作用，由于MVs其磷脂膜結(jié)構(gòu)特殊性，在IRI中能夠保護(hù)其內(nèi)含蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，不受周圍改變的環(huán)境影響，通過其磷脂結(jié)構(gòu)發(fā)生膜融合或胞吞作用或者吞噬作用進(jìn)入心肌細(xì)胞，其含蛋白質(zhì)部分是酶類，酶催化具有高效性，能夠放大其效應(yīng)[12]，雖然MVs包含蛋白質(zhì)和RNA，但在IRI中發(fā)揮主要作用的更傾向于蛋白質(zhì)，不像RNA發(fā)揮作用需要過程相對(duì)較長(zhǎng)且消耗ATP的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)能夠即時(shí)迅速發(fā)揮作用[13]。

2.1 改善能量代謝MVs包含了多種糖酵解相關(guān)的蛋白，如3-磷酸甘油醛脫氫酶、蛋白激酶G、M2型丙酮酸激酶等，如前述IRI時(shí)這些酶缺失，MVs通過補(bǔ)充這些關(guān)鍵酶，提高糖酵解通量和腺苷三磷酸（ATP）產(chǎn)量，IRI時(shí)從有氧代謝到無氧代謝的轉(zhuǎn)變對(duì)保護(hù)心肌非常關(guān)鍵，雖然有氧氧化1分子的葡萄糖產(chǎn)生38個(gè)ATP，無氧酵解產(chǎn)生2個(gè)ATP，但是同樣的時(shí)間內(nèi)，無氧酵解相比有氧氧化1 min內(nèi)能夠產(chǎn)生3倍多的ATP，這短暫而快速產(chǎn)生的ATP能夠及時(shí)為早期缺血心肌提供啟動(dòng)修復(fù)程序的能量[14]。ATP明顯下降可進(jìn)一步引起一系列代謝異常和紊亂，細(xì)胞膜、肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活力及肌漿網(wǎng)鈣攝取能力下降，使Ca2+內(nèi)流增加并激活膜磷酶，使膜磷脂降解為溶血磷脂，導(dǎo)致缺血性肌攣縮，在此過程中產(chǎn)生氧自由基進(jìn)一步產(chǎn)生損害作用；依賴ATP的細(xì)胞膜泵活性降低，膜電位改變及心電圖ST段改變。能量代謝障礙可造成心肌細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)的異常，細(xì)胞內(nèi)的ATP水平是決定細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死的主要因素。MVs通過提供糖酵解的關(guān)鍵酶提升ATP產(chǎn)量有助于恢復(fù)離子穩(wěn)態(tài)，是其對(duì)細(xì)胞損傷保護(hù)機(jī)制之一。另外糖酵解的增強(qiáng)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物為合成代謝所需要，從而支持細(xì)胞的生存和修復(fù)。實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)微囊處理的小鼠IRI心肌ATP產(chǎn)量增加以及心肌梗死面積減少[15]。

2.2 抑制細(xì)胞凋亡MI/R的發(fā)生與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡是IRI的特征性改變，細(xì)胞凋亡的多少?zèng)Q定著IRI的輕重。研究顯示，抑制心肌細(xì)胞凋亡，可以減輕心肌IRI[16]?？沟蛲龅囊恍┑鞍准っ溉鏏KT、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）的激活被證實(shí)在IRI時(shí)對(duì)心肌有保護(hù)作用。AKT、ERK1/2歸屬于體內(nèi)兩條最重要的存活信號(hào)通路即Ras/Raf/MEK/ERK（MAPK）和PTEN/PI3K/ AKT/mTORMVs，這些通路的激活對(duì)于組織修復(fù)和損傷的減輕，包括MI/R具有重要作用，MVs表達(dá)MSC特異性抗原CD73，具有MSC部分功能，CD73[17]是目前最可能的參與抗凋亡的蛋白，是目前已知唯一能夠水解細(xì)胞外腺嘌呤核糖核苷酸（AMP）為腺苷的5-核苷酸酶，腺苷通過磷酸化激活ERK和AKT信號(hào)通路，維護(hù)細(xì)胞的生存，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)均已經(jīng)證實(shí)能夠減輕IRI[18]，MI/R時(shí)，ATP和腺苷二磷酸被釋放到細(xì)胞外間隙，并且很快被降解為AMP，AMP正是CD73作用的底物。

2.3 抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞損傷補(bǔ)體系統(tǒng)是血清及體液中的一組具有酶活性的蛋白質(zhì)。補(bǔ)體系統(tǒng)在IRI通過多種途徑被激活，形成大量的活化片段。許多證據(jù)均表明，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活在IRI中發(fā)揮著重要作用[19]，其通過直接作用和對(duì)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的間接作用造成組織器官損傷。損傷機(jī)制包括：補(bǔ)體激活后最終生成攻膜復(fù)合體（MAC），MAC嵌入細(xì)胞膜內(nèi)形成貫通胞膜的圓形孔道，引起水、鈉和鈣離子內(nèi)流，造成細(xì)胞腫脹和鈣超負(fù)，從而崩解死亡；同時(shí)MAC和C5a還可誘導(dǎo)p21（ras）表達(dá)引起細(xì)胞凋亡；CD59是一個(gè)廣泛表達(dá)的糖基磷脂酰肌醇錨定膜蛋白，可以結(jié)合MAC上的C8和C9，干擾MAC嵌入和圓形孔道形成，從而抑制MAC介導(dǎo)的細(xì)胞裂解，MVs含有CD59分子，通過抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，可能是IRI時(shí)MVs對(duì)心肌保護(hù)機(jī)制之一[20]。

3 展望

MSC作為一種細(xì)胞治療已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)階段，但臨床應(yīng)用尚存在靜脈滴注可致心律失常、毛細(xì)血管床阻塞，在體內(nèi)進(jìn)行成骨、成軟骨方向分化，以及宿主排異、腫瘤形成風(fēng)險(xiǎn)等安全隱患[21]。MVs具有MSC的修復(fù)作用，同時(shí)具有選擇性組裝、靶向性投遞、保存穩(wěn)定等特點(diǎn)，能遠(yuǎn)距離、長(zhǎng)時(shí)程、多靶點(diǎn)的高效作用于相應(yīng)組織，有希望成為一種既具有MSC作用特點(diǎn)而又能規(guī)避其缺陷的新型治療缺血性心臟病的手段[22]，MVs作為獨(dú)特的胞外細(xì)胞器，內(nèi)含種類豐富的蛋白質(zhì)，通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)可以對(duì)心肌起保護(hù)作用。目前，人們對(duì)MVs作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)還不夠全面，如MVs具體的生物活性成分、調(diào)節(jié)MVs內(nèi)生物活性分子聚集、釋放的信號(hào)通路以及MVs表面配體的特異性結(jié)合等問題有待于更多的研究來闡明。

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A

1009-5519（2014）12-1807-03

2014-01-30）

廣東省湛江市財(cái)政資金科技專項(xiàng)競(jìng)爭(zhēng)性分配項(xiàng)目（2011D0302）。

洪勉名（1987-），男，廣東海豐人，碩士研究生，主要從事間充質(zhì)干細(xì)胞與冠心病治療研究；E-mail：kyless@126.com。