李帥鵬,黃顯會,許 穎,郭春娜,孔祥凱
(華南農業(yè)大學,國家獸藥殘留基準實驗室,廣東廣州 510642)
阿莫西林(Amoxicillin)又名羥氨芐青霉素,是一種最常用的青霉素類廣譜β-內酰胺類抗生素,具有殺菌能力強,口服吸收好,血藥濃度高,且不受食物影響的特點[1],醫(yī)學和獸醫(yī)臨床應用廣泛.阿莫西林對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、炭疽桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等幾種常見的致病菌具有較強的抗菌活性,廣泛應用于治療各種動物泌尿道、呼吸道和皮膚的敏感菌感染[2].國外已批準用于治療牛、犬和貓的疾病,國內已批準使用阿莫西林治療牛、豬和家禽的敏感菌感染.其作用機理是與細菌胞質膜上的青霉素結合蛋白(PBPs)結合,使其失去活性,導致細胞壁合成受阻,最終使細菌裂解而死亡[3].
奶中阿莫西林的殘留,會引起敏感人群的過敏反應和細菌耐藥性的增加,導致奶制品質量和產量下降,給乳品加工業(yè)帶來巨大經濟損失.阿莫西林殘留是當前歐盟和北美等國家對進口動物食品的必檢項目之一[4].為確保消費者健康,避免消費者受到阿莫西林殘留的危害,許多國家規(guī)定了阿莫西林的最高殘留限量(Maximum residue limit,MRL).歐盟規(guī)定牛奶中阿莫西林的最高殘留限量為4μg·L-1[5],農業(yè)部第235號公告規(guī)定食品動物中靶組織的最高殘留限量分別是50(肌肉、脂肪、肝臟、腎臟)和10(奶)μg·kg-1[6].
奶、蜂蜜和組織中阿莫西林的檢測方法目前報道的有微生物檢測法[7-8]、酶聯(lián)免疫分析法[9]、高效液相色譜與熒光檢測器[1]、紫外檢測器[2,4,10-11]和質譜檢測器[12-21]聯(lián)用.高效液相色譜法的靈敏度低,樣品處理通過衍生化和SPE柱凈化來實現(xiàn),操作繁瑣;高效液相色譜-質譜聯(lián)用法多為β-內酰胺類抗生素多殘留檢測,對奶中阿莫西林殘留檢測的專屬性不強,且均需要SPE柱凈化,成本較高.本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)分析奶中阿莫西林殘留,通過乙醇提取,正己烷凈化來實現(xiàn)對目標物的處理,該方法操作簡單快速,避免了衍生化和SPE柱凈化的繁瑣步驟,成本較低,靈敏度高,精密度和重復性好.
API 4000電噴霧-串聯(lián)四極桿質譜儀,配 Analyst4.1.5軟件(美國應用生物系統(tǒng)公司);Agilent 1200型液相色譜儀(美國安捷倫公司);旋轉蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司);Milli-Q純水機(美國Millipore公司);Mach1.6 R冷凍型離心機(美國Thermo公司);Luna 5μm C18色譜柱(美國Phenomenex公司).阿莫西林標準品:質量分數(shù)為 86.4%,批號K0221206,為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產品;甲酸和乙腈為色譜純(德國CNW公司);乙醇、正己烷、乙酸銨均為國產分析純.
500 mg·L-1阿莫西林標準溶液:精密稱取5.79 mg阿莫西林標準品,置于10 mL容量瓶中,用體積分數(shù)為50%甲醇乙腈溶液溶解并定容至刻度,配成500 mg·L-1標準溶液,于4℃冰箱中避光保存.臨用前用pH 4.5的乙酸銨溶液稀釋成阿莫西林系列標準工作溶液.10 mmol·L-1乙酸銨溶液:精密稱取乙酸銨0.154 g,用純水溶解并定容至200 mL,冰醋酸調pH至4.5.
稱取2 g空白奶樣品于15 mL EP管中,加入8 mL乙醇,旋渦混勻1 min,以10 000 r·min-1(溫度低于4℃)離心15 min;轉移上清液至梨形瓶中,37℃條件旋轉蒸發(fā)至約0.5 mL,取下梨形瓶,立即加入乙酸銨溶液1 mL,旋渦混勻1 min,轉移溶液至另一15 mL EP管中,用乙酸銨溶液定容至2 mL;取1 mL上述溶液于2 mL EP管中,加入正己烷0.8 mL除脂,渦旋混勻,以10 000 r·min-1(溫度低于4℃)離心10 min,棄去上層正己烷,下層水相過0.22μm水相濾膜,供HPLC-MS/MS檢測.
精密稱取2 g空白奶樣品于15 mL EP管中,按“1.3”方法處理樣品,用所得空白基質液將阿莫西林標準工作液稀釋成 1、2、5、10、50、100、400 μg·L-1,用HPLC-MS/MS進行檢測.每一水平設5個平行樣品同日檢測,連續(xù)測定5日.以測得阿莫西林峰面積平均值為縱坐標(y),質量濃度(μg·L-1)為橫坐標(x)繪制標準曲線,求得其回歸方程和標準曲線.
精密稱取空白奶樣品2 g,依次加入不同質量濃度的阿莫西林標準工作液100μL,渦旋混勻,使得樣品中阿莫西林的添加質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·L-1,按“1.3”方法處理樣品.以信噪比S/N≥3確定檢出限(LOD),以信噪比S/N≥10確定定量下限(LOQ).
回收率和精密度的計算,采用在空白奶樣品中添加標準溶液的方法進行檢測.根據(jù)農業(yè)部對阿莫西林制定的 MRL及殘留控制要求,在 LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL 4 個添加水平,2 g空白奶樣品中分別添加 40、100、200、400 μg·L-1的阿莫西林標準工作液100μL,即奶中添加質量分數(shù)為2、5、10、20 μg·kg-1,旋渦混勻,按“1.3”方法處理樣品,每一水平設5個平行樣品同日檢測,連續(xù)測定5日.求得空白奶中添加阿莫西林回收率的平均值(X)和標準差(SD),同時計算日內和日間相對標準偏差.
從市場購買新鮮牛奶和羊奶100 mL,牛奶和羊奶樣品各取15份,共抽檢30份樣品,每份樣品2個重復,按“1.3”方法進行制樣和檢測.
1.8.1 色譜分離條件 Luna 5μm C18色譜柱(150 mm×2.1mm,5μm;美國 Phenomenex公司);流動相A為乙腈,流動相B為體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液,梯度洗脫程序:0~1 min,0~40%A;1~3.5 min,40%A;3.5~4 min,40% ~0 A;4 ~10 min,0 A;流速:0.25 mL/min;柱溫:35℃;進樣量:5μL.
1.8.2 質譜條件 ESI正離子模式掃描(ESI+),多反應監(jiān)測(MRM)采集方式;離子源溫度700℃,電噴霧電壓4 kV,霧化氣壓力55 kPa,輔助氣壓力35 kPa,氣簾氣壓力15 kPa.阿莫西林的多反應監(jiān)測質譜檢測參數(shù):母離子m/z為366.3,子離子 m/z為349.2、208.2,其中m/z366.3/349.2為定量離子對;碰撞能量(CE)13 eV/19 eV;去簇電壓(DP)58/45 V;碰撞室射出電壓(CXP)10 V;射入電壓(EP)10 V.
阿莫西林標準溶液(1 mg·L-1)分別在正離子和負離子模式下全掃描,發(fā)現(xiàn)阿莫西林在正離子模式下的響應值更高.阿莫西林標準溶液(1 mg·L-1)在正離子模式下全掃描,得到[M+H]+(m/z 366.3)準分子離子峰.對m/z 366.3進行二級質譜全掃描,得到阿莫西林二級全掃描質譜圖.阿莫西林的質譜行為較簡單,主要為分子脫NH3生成的[MNH3+H]+(m/z 349.2)和β-內酰胺斷裂生成的m/z208.2、113.9和160.0.在多反應監(jiān)測正離子模式下,改變碰撞能量,其中m/z 349.2和208.2的強度相對較大,干擾較小,選擇m/z 208.2為輔助定性離子,m/z349.2為定量離子.
按“1.4”方法進行操作,得牛奶中阿莫西林的回歸方程y=3 868.9x+546.4,相關系數(shù)r=0.999 8;羊奶中阿莫西林的回歸方程y=4 041.8x+1 254.0,相關系數(shù)r=0.999 4.
以信噪比S/N≥3確定檢出限(LOD),以信噪比S/N≥10確定定量下限(LOQ).得出阿莫西林在奶中的檢出限為1μg·kg-1,定量下限為2μg·kg-1,滿足殘留檢測的要求.
回收率和精密度的計算,采用在空白奶樣品中添加標準溶液的方法進行檢測,其多反應監(jiān)測質譜圖如圖1所示.由表1可知,阿莫西林在奶中的平均回收率介于75.6% ~91.0%,日內相對標準偏差為1.6% ~10.2%,日間相對標準偏差為 3.5% ~8.2%,滿足獸藥殘留檢測方法的要求.
抽樣(牛、羊奶各15份)檢測結果顯示,2份牛奶檢測出6μg·kg-1的殘留(未超過殘留限量,阿莫西林在奶的MRL為10μg·kg-1),1份羊奶檢測出15μg·kg-1的阿莫西林殘留(超過了殘留限量),其余樣品未檢測出阿莫西林殘留.表明該方法可檢測牛奶和羊奶中阿莫西林的殘留量,在生產實際中可用于檢測奶中阿莫西林的殘留.
圖1 空白(A、B)和空白添加阿莫西林(a、b,2μg·kg-1)奶樣品的多反應監(jiān)測質譜圖Fig.1 MRM chromatogram of blank milk samples(A,B)and spiked with amoxicillin at2 μg·kg-1(a,b)
表1 奶中阿莫西林的加標回收率及相對標準偏差(n=5)Tab.1 Recoveries and relative standard deviations(RSD)of amoxicillin spiked in m ilk(n=5)
阿莫西林的極性較小,是有機弱酸性物質,在C18色譜柱上能較好地保留.研究考察了Gemini C18(150 mm×4.6 mm,粒徑3.5μm)和Luna C18(2.1 mm×150 mm,粒徑5μm)2種色譜柱的分離效果,發(fā)現(xiàn)在Gemini C18色譜柱上藥物峰形寬大,分離效果差,而且柱壓較高,不予采用,因此采用Luna C18(2.1 mm×150 mm,粒徑5μm)色譜柱.本試驗流動相的有機相成分為乙腈,在水相中加入體積分數(shù)為0.1%的甲酸[22]使阿莫西林的響應值更高,峰形尖銳,分離度更好.說明甲酸促進了阿莫西林的離子化.
分析樣品中阿莫西林殘留的方法有微生物測定法、免疫分析法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質譜法等.通過文獻對比發(fā)現(xiàn):微生物法由于動物源性食品中干擾物質多,且具備抑菌作用的抗生素種類繁多,使其結果假陽性率較高,準確性較差,而且缺乏特異性.高效液相色譜法測定青霉素類藥物殘留通常用反相液相色譜法,紫外檢測器進行定量.但由于測定波長在200~235 nm,基體干擾明顯,無法應用于實際樣品中藥物含量測定.人們開發(fā)了測定衍生化青霉素的方法,通過提高檢測波長來消除基體干擾[4].但實際樣品中阿莫西林殘留分析之前,都要經過繁瑣費時的衍生化[1-2,4,10-11]過程.液相色譜 -串聯(lián)質譜法采用多離子通道系統(tǒng)進行藥物分析,分離能力強,精確可靠,用于測定阿莫西林的殘留時避免了衍生化的繁瑣步驟,但都要用SPE柱進行凈化[13-18,20-21],所需試劑的種類和數(shù)量較多,成本較高.本研究運用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)檢測奶中阿莫西林的殘留,通過8 mL乙醇提取,旋轉蒸發(fā)至0.5 mL后用乙酸銨溶液定容,正己烷凈化來實現(xiàn)對目標物的處理,該方法操作簡單快速,避免了衍生化和SPE柱凈化的繁瑣步驟,前處理過程僅需要乙醇、乙酸銨和正己烷3種試劑,成本較低,效率高(單個樣品前處理時間在40 min左右),適用于生產實踐中大批量樣品的快速檢測.
已報道的文獻資料中,用來沉淀牛奶中蛋白質的有機溶劑主要有乙腈[1,12,17-18]和三氯乙酸[2,10],也有采用乙酸鉛[14]的報道.這些報道的樣品前處理方法中,大部分都包含了操作繁瑣的固相萃取(SPE)凈化步驟.本試驗采用乙腈、甲醇和乙醇[19]來去除奶中的蛋白質.結果顯示乙醇沉淀蛋白質的效果最好,阿莫西林的回收率較高(75% 以上),而乙腈和甲醇沉淀蛋白質后阿莫西林的回收率在60%左右.由于阿莫西林不穩(wěn)定,為了防止目標物降解,在旋轉蒸發(fā)至約0.5 mL 后,分別加入 pH 為 3.0、4.5、5.0、6.0 的乙酸銨溶液,考察其提取效果,試驗結果表明阿莫西林在pH 4.5的乙酸銨溶液中最穩(wěn)定,回收率最高.由于離子濃度對阿莫西林有一定影響,比較了10與50 mmol·L-1乙酸銨溶液提取結果的回收率,發(fā)現(xiàn)10 mmol·L-1乙酸銨溶液回收率高于50 mmol·L-1乙酸銨溶液.樣品提取溶液經過高速低溫離心和0.22μm微孔濾膜過濾后進行HPLC-MS/MS分析,檢測結果表明樣品提取溶液足夠干凈,不會對阿莫西林的檢測產生顯著的干擾.
本試驗運用旋轉蒸發(fā)的方式去除提取溶液中的乙醇,對阿莫西林進行濃縮.阿莫西林本身不穩(wěn)定,在溶液條件下會加速阿莫西林的降解,提高蒸發(fā)濃縮的溫度會加快乙醇的揮發(fā),同時也會加速阿莫西林的降解.因此選擇在30、37和40℃條件下進行對比試驗.發(fā)現(xiàn)在37℃條件下濃縮效率高(單個樣品蒸發(fā)濃縮至0.5 mL需要6 min),方法的回收率也較高(75%以上).本試驗同時嘗試將提取液完全吹干,由于耗時較長,阿莫西林的降解導致方法回收率降低(回收率只有50% ~60%),處理方法上采用了在37℃條件下蒸發(fā)濃縮至0.5 mL的方式.
樣品基質溶液對目標物的電噴霧離子化有很大影響,可增強或抑制信號響應,進而影響測定結果的準確度與精密度[23].本試驗通過在空白奶基質提取液中添加低、中、高 3個質量濃度即 5、50、200 μg·L-1的阿莫西林標準溶液,與純溶劑中的信號強度進行比較,奶基質峰面積與純溶劑的峰面積比值為70%~86%,說明牛奶和羊奶基質對阿莫西林檢測均有抑制效應.為消除樣品基質效應的影響,采用空白基質匹配標準溶液法[24]進行校準.
本文建立了HPLC-MS/MS法測定奶中阿莫西林殘留量的分析方法.樣品經乙醇提取,提取液經旋轉蒸發(fā)濃縮后用乙酸銨溶液復溶,復溶液用正己烷去除脂肪后,經液相色譜-串聯(lián)質譜分析.本方法前處理操作簡便易行,不需要SPE柱凈化,所需試劑較少,成本較低;同HPLC法相比,HPLC-MS/MS法避免了衍生化和SPE柱凈化的繁瑣步驟,而且精密度和重復性好,靈敏度高,定量限低于歐盟對奶中阿莫西林制定的最高殘留限量,適用于奶中阿莫西林的殘留檢測.
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【責任編輯 柴 焰】