趙青松，趙云云，王 朋，鄧小娟，馬啟彬，年 海，楊存義

(1亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)和利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省植物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家大豆改良中心廣東分中心/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東廣州 510642;2河北農(nóng)林科學(xué)院糧油作物所/國家大豆改良中心石家莊分中心，河北石家莊 050035)

中國是大豆的起源地，擁有豐富的種質(zhì)資源［1］.野生大豆是栽培大豆的祖先，蘊(yùn)含著許多優(yōu)良基因［2-5］.野生大豆在中國廣泛分布，從北緯53°的漠河到北緯24°的象州均有分布［6］.野生大豆資源的有效保護(hù)和利用是建立在了解野生大豆遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上.目前已利用形態(tài)性狀、同工酶、分子標(biāo)記等在不同水平上對中國野生大豆的遺傳多樣性進(jìn)行了廣泛研究.從全國范圍對野生大豆遺傳多樣性的分析表明野生大豆擁有比栽培大豆更高的遺傳多樣性［7-9］.在全國范圍內(nèi)的野生大豆地理群體中，43% ～92%的遺傳變異存在于居群內(nèi)，大多數(shù)居群存在遺傳瓶頸效應(yīng)［10-13］.多個(gè)研究結(jié)果也表明西南部和南方是野生大豆的一個(gè)主要多樣性中心［10-11］，但也有研究結(jié)果認(rèn)為中國有多個(gè)多樣性中心，分別位于黃河流域、中國中部和長江流域［13］.研究表明，浙江［14］、河北省［15-16］、重慶［17］、湖南和湖北［18］、江西［19］、廣西［20］、西藏［21］和北京［22］等區(qū)域內(nèi)的野生大豆群體間也存在豐富的遺傳多樣性.

小尺度空間范圍對野生大豆居群的遺傳多樣性研究可提供居群在特定微環(huán)境中演化和分化的信息，也為自然居群的取樣提供理論依據(jù)［23］.從小尺度范圍內(nèi)已對我國遼寧新賓縣野生大豆保護(hù)區(qū)野生大豆居群［24］、吉林省龍井保護(hù)區(qū)野生大豆居群［25］、山東墾利黃河口自然保護(hù)區(qū)野生大豆居群［26］、上海江灣野生大豆居群［23，27］的遺傳多樣性做了分析，結(jié)論不盡相同.多數(shù)分析結(jié)果認(rèn)為受野生大豆種子、花粉傳播和微環(huán)境的影響，居群內(nèi)的遺傳變異并不完全呈隨機(jī)分布，而呈斑塊狀分布，居群的遺傳多樣性與地理分布存在相關(guān).但對浙江金華的自然群體分析結(jié)果表明遺傳距離與地理距離無明顯相關(guān)性［13］.這主要是因?yàn)樾〕叨确秶尤旱亩鄻有灾饕赏蛔円?，隨機(jī)漂變是其空間分布的主要因素，而影響大尺度居群分布的光、溫等因素的作用較小.

目前已有的小尺度居群分析多集中在黃淮海流域和東北地區(qū)野生大豆群落，而多個(gè)研究都認(rèn)為中國南方、西南部為中國野生大豆的多樣性中心［10-11］，也是野生大豆的起源中心［7，28］，但對該區(qū)域內(nèi)野生大豆小尺度分析及居群之間進(jìn)化及其演變關(guān)系報(bào)道較少.研究認(rèn)為南方野生大豆與栽培大豆的細(xì)胞器DNA最接近［8］，尤其北緯25°左右野生大豆可能與栽培大豆的起源有關(guān)［29-30］.上述研究結(jié)論是利用了國家資源庫中的野生大豆資源得出，而利用該區(qū)域自然群體研究的報(bào)道不多.

地處北緯25°的南嶺是我國重要的自然地理分界線，南嶺的南北坡降水和溫度差異明顯.北緯25°附近也是目前已知野生大豆分布的最南端，其中湖南新田大冠嶺位于南嶺北，分布著豐富的野生大豆，一些野生大豆居群的遺傳多樣性遠(yuǎn)高于周圍的自然居群［31］.本研究采用SSR標(biāo)記對分布在大冠嶺周圍的野生大豆自然居群遺傳多樣性、空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以揭示該地區(qū)野生大豆居群間關(guān)系及其演變關(guān)系，旨在為中國南方野生大豆資源的有效利用和資源保護(hù)提供理論指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材料及來源

2007年在湖南省新田縣大冠嶺及其周圍的16個(gè)野生大豆Glycine soja Sieb.et Zucc.自然居群中依據(jù)群體大小隨機(jī)采集612份個(gè)體的新鮮葉子用于DNA提取和SSR分析，并用GPS定位儀對取樣植株地理位置定位，記錄采樣點(diǎn)面積、生境等相關(guān)信息(表1).

表1 野生大豆居群采集地點(diǎn)及相關(guān)信息Tab.1 The samp ling sites and related informations of soybean populations

1.2 基因組提取及SSR擴(kuò)增

參照Cregan等［32］建立的大豆分子標(biāo)記連鎖圖，從每個(gè)連鎖群上等距離選擇2～3個(gè)SSR位點(diǎn)，共選用41對引物(表2).基因組DNA提取和 SSR擴(kuò)增與文獻(xiàn)［31］一致.

1.3 野生大豆居群的遺傳多樣性分析

居群多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)(Polimophism，P):P=l/T×100%，l為居群(或個(gè)體)觀測到的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)，T為總?cè)后w所觀測到的多態(tài)性位點(diǎn)總數(shù).位點(diǎn)等位基因數(shù)(Number of alleles at locus，Na):某位點(diǎn)在所有居群中檢測到的等位變異數(shù).群體平均等位基因數(shù)(Mean number of alleles per locus，Nap):某居群在所有位點(diǎn)上所檢測到等位變異數(shù)的平均值.期望雜合度(Expected heterozygosity，He)和Shannon指數(shù)(I):

1.4 遺傳結(jié)構(gòu)分析及聚類分析

應(yīng)用 Cregan 等［32］和 Pritchard 等［33］的基于混合模型的多位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)聚類分析方法(軟件Structure 2.3)對供試野生大豆居群聚類，并確定材料的血緣組成.具體分析過程，先設(shè)定群體數(shù)目(K)為2～30，并假定位點(diǎn)都是獨(dú)立的，將 MCMC(Markov chain Monte Carlo)開始時(shí)的不作數(shù)迭代(Length of burn-in period)設(shè)為10 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC迭代設(shè)為100 000次，然后依據(jù)似然值最大的原則選取一個(gè)合適的K值并且畫出基于模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖.群體的主成份分析用GenAlEx6.5軟件計(jì)算［33］.

1.5 遺傳結(jié)構(gòu)與地理分布相關(guān)評價(jià)

用Mental test矩陣相關(guān)檢測遺傳距離和地理距離的相關(guān)性.用空間自相關(guān)系數(shù)(r)來衡量野生大豆居群的空間遺傳結(jié)構(gòu)，即樣本個(gè)體間空間距離對和遺傳距離對之間的相關(guān)系數(shù)，以上數(shù)據(jù)采用GeneA-lEx6.5 計(jì)算［33］.

2 結(jié)果與分析

2.1 大冠嶺及其周圍區(qū)域各居群的地理分布

調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，野生大豆居群往往分布在離村莊或耕地不遠(yuǎn)的地方，如水溝邊、池塘邊、田埂旁、路邊等地方.位于大冠嶺區(qū)域的快樂洞(KLD)、桑梓村(SZ)和向西嶺(XXL)一帶分布較大面積的野生大豆，而遠(yuǎn)離大冠嶺地區(qū)的野生大豆零星分布.在大冠嶺及其周圍區(qū)域共采集了16個(gè)居群612個(gè)樣本(表1)，其中新田縣城西1 km處(XT1)和6 km處(XT6)2個(gè)較小的自然居群處于公路邊，地勢較平坦，長富村(CH)、茂家(MJ)和三下洞(SXD)自然居群則位于新田縣城南部，其余11個(gè)居群位于大冠嶺及其周邊地區(qū).大冠嶺向西嶺(XXL)一帶海拔較高，周邊海拔逐漸降低，形成復(fù)雜地形地貌.

2.2 大冠嶺及其周圍區(qū)域野生大豆居群遺傳多樣性分析

分子標(biāo)記結(jié)果顯示，41個(gè)位點(diǎn)共檢測到414個(gè)等位變異，位點(diǎn)等位變異數(shù)目范圍為4～19個(gè)，平均值為10.1個(gè)，Satt269、Satt073、Satt497等位變異最少，只有4個(gè)，而Sat_177等位變異最多，為19個(gè).≥10個(gè)等位變異的位點(diǎn)有20個(gè)，＜10個(gè)等位變異的位點(diǎn)有21個(gè).位點(diǎn)的I值變化范圍0.283～2.542，平均為1.751，He值變化范圍0.096～0.909，平均為0.751(表2).

表2 41個(gè)位點(diǎn)在16個(gè)野生大豆居群中的遺傳多樣性參數(shù)1)Tab.2 The genetic diversity of 41 lociamong 16 w ild soybean populations

41對引物在各居群中均具有多態(tài)性，居群平均位點(diǎn)多態(tài)性為66.09%(表3).多態(tài)位點(diǎn)百分率大于90%的居群有 7 個(gè)，分別是 KLD、LX、LXHS、SY、SZ、SZLB、XXL，其中 XXL最高，多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)為100%.16個(gè)野生大豆居群He變化范圍為0.062～0.610，信息指數(shù)變化范圍為0.118～1.228.從空間分布發(fā)現(xiàn)大冠嶺區(qū)域的向西嶺(XXL)至桑梓一帶野生大豆遺傳多樣性較高，而遠(yuǎn)離大冠嶺的新潭鋪(XTP)、三下洞(SXD)、茂家(MJ)、長富(CH)、新田縣城西1 km(XT1)和新田縣城西6 km(XT6)居群的遺傳多樣性較低.

在16個(gè)居群中總共檢測到126個(gè)特有等位基因，不同居群內(nèi)的特有等位基因數(shù)不同，XXL、SY、KLD、SZ幾個(gè)居群的野生大豆的特有等位基因較多，而MJ、SZLB、XTP、QL等居群的特有等位基因較少(表3).KLD野生大豆居群位于大冠嶺山上一個(gè)村莊附近，此處野生大豆居群特有等位基因最多，但遺傳多樣性不是最高，可能是稀有等位基因較多，桑梓路邊遺傳多樣性較高，但特有等位基因較少，這是因?yàn)樯ｈ髀愤呉吧蠖咕尤号c桑梓居群相鄰，居群間有重疊，所以特有等位基因較少.

表3 16個(gè)野生大豆居群的遺傳多樣性參數(shù)1)Tab.3 The genetic diversity of 16 w ild soybean populations

2.3 野生大豆居群遺傳分化與基因流

自然居群間分化程度可用分化系數(shù)和基因流來描述，居群間分化系數(shù)越大，基因流越小，居群差異就越大.新田大冠嶺區(qū)域野生大豆自然居群間的分化系數(shù)和基因流變化范圍分別為0.114～0.848和0.052～1.978.居群間基因流＞1的有12對，＜0.1的有10對.向西嶺、桑梓、桑梓路邊與周邊居群分化系數(shù)較小，基因流較大(表4).推測大冠嶺區(qū)域內(nèi)野生大豆原來是一個(gè)大群落，可能由于人類活動(dòng)、氣候、地理等因素的影響而被割裂.大冠嶺山上大部分居群與山腳下和遠(yuǎn)離大冠嶺自然居群間分化系數(shù)和基因流處于中間，表明山下和遠(yuǎn)離大冠嶺自然居群是早期由山上群體傳播形成.遠(yuǎn)離大冠嶺的自然居群間及與大冠嶺山腳下的自然居群間分化系數(shù)大，基因流較小.新田西1 km處居群和其他居群的基因流均較小，說明新田1 km處和其他居群的來源不同(表4).主成分分析進(jìn)一步表明向西嶺有向外擴(kuò)散趨勢，由此推測大冠嶺各居群可能始于向西嶺居群(圖1).

表4 30對最大和最小居群間成對基因流和分化系數(shù)Tab.4 The gene flow and differentiation coefficient of the most and the least 30 pair populations

圖1 野生大豆居群主成分分析Fig.1 Principal component analysis of wild soybean populations

2.4 大冠嶺及其周圍區(qū)域野生大豆遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Structure 2.3軟件對野生大豆居群進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，在K=19時(shí)似然值最大，因此認(rèn)為大冠嶺野生大豆居群分為19組較為合理，其中有9個(gè)組是由1個(gè)居群的個(gè)體組成的，分別由XT1、SXD、CH、SY、MJ、XT6、LXHS、LX、GK、QL 居群組成.另外10組則包括了不同居群的個(gè)體.遺傳結(jié)構(gòu)圖(圖2a)表明，19個(gè)組界限明顯，其中第8、12、15、18組成員組成較為復(fù)雜，大部分都存在居群SZ、SZBL、XXL的個(gè)體.說明這幾個(gè)居群遺傳多樣性較高.從居群的結(jié)構(gòu)圖(圖2b)也可以發(fā)現(xiàn)KLD、GK、SY等居群中個(gè)體為不同組的混合，說明這些居群個(gè)體來源于臨近野生大豆居群.從空間分布看，混合組主要是由大冠嶺周圍的自然居群組成，遠(yuǎn)離大冠嶺的自然居群只有CH和SY的部分個(gè)體進(jìn)入了混合組.由此推測大冠嶺山上的野生大豆自然居群曾連片分布，現(xiàn)有居群是近期人類活動(dòng)所致.

圖2 大冠嶺野生大豆群體的遺傳結(jié)構(gòu)Fig.2 The genetic structure ofwild soybean population of Daguanling

2.5 遺傳結(jié)構(gòu)與地理距離的關(guān)系

遺傳距離矩陣和地理距離矩陣的Mental檢驗(yàn)顯示，兩者之間相關(guān)系數(shù)達(dá)0.543(P＜0.01)，表明遺傳距離和地理距離存在線性相關(guān)關(guān)系，即隨著地理距離的加大，居群間的遺傳距離也有增大的趨勢(圖3).而空間自相關(guān)分析(圖4)表明，隨著地理距離的增加，居群間遺傳距離和地理距離的相關(guān)性呈下降趨勢，在置信區(qū)間95%以下，與橫坐標(biāo)的截距在1 400 m以內(nèi)空間自相關(guān)系數(shù)(r)為正值，在1 700 m以外r為負(fù)值.這一結(jié)果表明在1 400 m以內(nèi)，野生大豆的遺傳距離和地理距離呈正相關(guān)，即地理距離越近，遺傳距離也越近;而在1 700 m以外，遺傳距離和地理距離沒有相關(guān)性.

圖3 16個(gè)野生大豆居群地理距離和遺傳距離相關(guān)結(jié)果Fig.3 The correlation between geographic distance and genetic distance of 16 wild soybean populations

圖4 基于41對引物野生大豆的空間自相關(guān)分析結(jié)果Fig.4 Spatial autocorrelation analysis of wild soybean based on 41 loci

分析海拔與遺傳多樣性之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，隨著海拔的升高，居群的等位變異數(shù)、期望雜合度和信息指數(shù)有逐漸升高的趨勢.居群XT1海拔較低(218 m)，具有最低的遺傳多樣性，等位變異數(shù)、信息指數(shù)和期望雜合分別為1.235、0.118和0.062;而居群XXL海拔最高(628 m)，等位變異數(shù)、信息指數(shù)和期望雜合度達(dá)到最大值，分別為5.168、1.228和0.610(表1、表3).這可能是由于海拔高野生大豆居群受人類活動(dòng)影響較少，保留了豐富的遺傳多樣性.

3 討論

3.1 湖南新田大冠嶺及其周圍區(qū)域存在一個(gè)野生大豆居群的多樣性中心

國內(nèi)外學(xué)者近年來利用形態(tài)性狀、同工酶、分子標(biāo)記等從宏觀尺度對中國野生大豆的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)南方野生大豆多樣性高，與栽培大豆遺傳親緣近，可能是栽培大豆的起源地之一［7-8］，也有學(xué)者認(rèn)為有多個(gè)野生大豆的多樣性中心，分別位于黃河流域、中國中部、和長江流域［11］.對國內(nèi)不同區(qū)域的野生大豆的群體結(jié)構(gòu)分析也表明區(qū)域內(nèi)野生大豆群體間也存在豐富的遺傳多樣性［11，16-23］等.小尺度空間范圍對野生大豆居群的遺傳多樣性研究可提供居群在特定微環(huán)境中演化和分化的信息，也為自然居群的取樣提供理論依據(jù)［24］.

調(diào)查發(fā)現(xiàn)湖南新田縣大冠嶺周圍廣泛分布野生大豆，多樣性高于遠(yuǎn)離大冠嶺的自然居群，推測該區(qū)域可能存在一個(gè)野生大豆的遺傳多樣性中心［31］.本研究在上次采樣的基礎(chǔ)之上圍繞大冠嶺密集調(diào)查采樣，在原采樣居群的基礎(chǔ)上又增加了GK、SY、KLD、XXL、SWW等幾個(gè)居群，同時(shí)在遠(yuǎn)離大冠嶺地方增加了XTP、SXD、MJ、CH等幾個(gè)居群，居群數(shù)目達(dá)到16個(gè).41對SSR引物分析的結(jié)果表明，位于大冠嶺山上的XXL、SZ、SZLB、KLD、SY 野生大豆居群的遺傳多樣性高，而遠(yuǎn)離大冠嶺的 CH、MJ、SXD、XTP、XT1、XT6野生大豆居群的遺傳多樣性非常低.成對基因流分析結(jié)果表明XXL和其他大部分居群間的基因流均較大.由以上結(jié)果推測向西嶺至桑梓一帶分布的野生大豆至少是大冠嶺及其周圍區(qū)域野生大豆的一個(gè)多樣性中心.

在小尺度范圍內(nèi)對我國遼寧新賓縣野生大豆保護(hù)區(qū)野生大豆居群［25］、吉林省龍井保護(hù)區(qū)野生大豆居群［26］、山東墾利黃河口自然保護(hù)區(qū)野生大豆居群［27］、上海江灣野生大豆居群［24，28］的遺傳多樣性分析認(rèn)為受野生大豆種子、花粉傳播和微環(huán)境的影響，居群內(nèi)的遺傳變異并不完全呈隨機(jī)分布，而呈斑塊狀分布，遺傳多樣性與地理分布存在相關(guān)性.湖南新田縣大冠嶺野生大豆多樣性分布呈斑塊狀，但向西嶺至桑梓一帶分布的野生大豆應(yīng)是人類活動(dòng)或氣候、地理因素造成的割裂，而其他居群是這一群體擴(kuò)散形成的.因此湖南新田縣野生大豆保護(hù)和利用應(yīng)以向西嶺為中心開展.

3.2 湖南新田大冠嶺及其周圍區(qū)域野生大豆遺傳多樣性地理分布及傳播方式

大冠嶺野生大豆居群表現(xiàn)出明顯的特征，位于海拔較高的向西嶺—桑梓一帶遺傳多樣性較高，遺傳距離與地理距離在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān).空間自相關(guān)結(jié)果顯示，在1 400 m以內(nèi)，遺傳距離和地理距離呈正相關(guān)，而1 700 m以外遺傳距離和地理距離沒有相關(guān)關(guān)系，這與Wang等［34］認(rèn)為野生大豆在生態(tài)系統(tǒng)中種子的傳播半徑為1.5 km相一致.

本研究認(rèn)為湖南新田縣大冠嶺的野生大豆是以向西嶺至桑梓一帶為中心向四周輻射傳播，主要證據(jù)可歸為以下幾點(diǎn):1)向西嶺至桑梓一帶海拔較高，野生大豆居群受人類破壞少，有利于野生大豆遺傳多樣性保存;2)向西嶺周圍均有野生大豆分布;3)此處是野生大豆的一個(gè)多性性中心，多樣性中心往往是起源中心;4)遺傳多樣性最豐富的向西嶺自然居群和其他野生大豆居群均有較大的基因流，而遠(yuǎn)離大冠嶺居群基因交流較小;5)此處地勢較高有利于種子借重力、雨水或風(fēng)力從高向低傳播;6)快樂洞(KLD)與茂家(MJ)分別位于海拔最高的向西嶺(XXL)兩側(cè)，地理距離較遠(yuǎn)，但KLD自然居群的部分個(gè)體與MJ自然居群的個(gè)體卻聚在同一組.湖南新田縣大冠嶺及其周圍野生大豆空間分布上的這一規(guī)律為野生大豆擴(kuò)散途徑研究提供了一個(gè)樣本.

3.3 湖南新田大冠嶺及其周圍區(qū)域野生大豆群體遺傳結(jié)構(gòu)模式

根據(jù)居群間基因交流方式，可以把群體遺傳結(jié)構(gòu)分為陸島模式、海島模式、階石模式、距離隔離模式和層次模式［35-38］.新田大冠嶺及其周圍的16個(gè)野生大豆居群遺傳距離和地理距離明顯相關(guān)，表明居群間的遺傳結(jié)構(gòu)模式符合距離隔離模式，可以認(rèn)為原來新田大冠嶺一帶是一個(gè)均勻分布的大群體，16個(gè)野生大豆居群在遺傳距離約為1.0處大冠嶺地區(qū)野生大豆居群聚為一類，也佐證了大冠嶺一帶原來可能是一個(gè)大的群體.由于野生大豆是自花授粉作物，基因交流方式之一為種子雨，野生大豆種子95%散布在3.5 m以內(nèi)［37］.鄰近的居群間基因交流的可能性要比相距較遠(yuǎn)的居群間大得多，而且由于基因頻率在居群間呈現(xiàn)連續(xù)變化，居群間的基因頻率差異小，導(dǎo)致居群間在地理位置和遺傳距離之間呈密切相關(guān).

調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)離大冠嶺地區(qū)的野生大豆居群面積一般較小，所以又可以把大冠嶺一帶野生大豆居群看成是“陸”，而把遠(yuǎn)離大冠嶺的居群看成是“島”，這樣，大冠嶺一帶居群和遠(yuǎn)離大冠嶺的其他居群的遺傳結(jié)構(gòu)就為陸島模式，“陸”基因向“島”的遷移會(huì)影響島基因頻率的變化，由于“島”較小，易產(chǎn)生漂變，同時(shí)也會(huì)降低居群的多樣性.所以遠(yuǎn)離大冠嶺居群與在大冠嶺地區(qū)居群之間以陸島模式存在.

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【責(zé)任編輯周志紅】