劉 玥，帥 春，尹 虹，宋艷斌*，馬文麗*

（1.南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所，廣東廣州510515;2.廣東省婦幼保健院新生兒科越秀院區(qū)，廣東廣州 510000）

miRNA可通過(guò)與靶mRNA特異性堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶mRNA降解或者抑制翻譯，進(jìn)而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控［1］。miR-196b位于7號(hào)染色體短臂（7p15.2），其高表達(dá)和許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如口腔癌［2］、胃癌［3］和鼻咽癌［4］等，也可作為胰腺上皮內(nèi)瘤變的診斷標(biāo)志物［5］，并可判斷成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和間變性星形細(xì)胞瘤患者的預(yù)后［6］。miR-196b和白血病的關(guān)系也很密切，其在混合系白血?。∕ixed Lineage Leukemia，MLL）［7］、B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋcute Lymphoblastic Leukemia，ALL）［8］患者中低表達(dá)，在 T 細(xì)胞 ALL 患者［9］、兒童ALL患者中［10］高表達(dá)。miR-196b可調(diào)節(jié)造血功能，并隨時(shí)間推移表達(dá)逐漸下降［11］。miR-196b在慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic Myeloid Leukemia，CML）中的研究很少，因此本研究通過(guò)構(gòu)建miR-196過(guò)表達(dá)載體，并在K562細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，為研究其對(duì)慢粒發(fā)生發(fā)展的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓樣本（南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院提供），與受試者簽署知情同意書(shū)并獲得南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)書(shū);質(zhì)粒 plVTHM、psPAX2、pMD2.G（南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院張寶副教授惠贈(zèng)）;K562細(xì)胞（廣東省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供）;293T細(xì)胞（南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供）;大腸桿菌 DH5α（Escherichia coli，E.coli）由本室保存。

Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（GE公司）;QIAamp?DNA Mini and Blood Mini Kit和QIAGEN Plasmid Midi Kit（Qiagen公司）;EX Taq DNA聚合酶和SYBR Premix Ex TaqⅡ（大連寶生物工程公司）;限制性?xún)?nèi)切酶和 T4 DNA連接酶（New England Biolabs公司）;Wizard? SV瓊脂糖膠和PCR產(chǎn)物純化系統(tǒng)（Promega公司）;胎牛血清（Gibco公司）;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）;Hairpin-itTMmicroRNA qPCR Quantitation Kit（上海吉瑪公司）;引物合成及測(cè)序由Invitrogen（廣州）公司完成;Cell Counting Kit（CCK-8）（DOJINDO公司）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體plVTHM-miR-196b:查詢(xún)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)獲得miR-196b前體pre-miR-196b序列為:5'-ACUGGUCGGUGAUUUAGGUAGUU UCCUGUUGUUGGGAUCCACCUUUCUCUCGACAGC ACGACACUGCCUUCAUUACUUCAGUUG-3'，在其上下游各添加100 bp的側(cè)翼序列，采用Primer5.0設(shè)計(jì)引物。上游引物P1序列為:端引入ClaⅠ和MluⅠ的酶切位點(diǎn)，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。采用Ficoll法分離正常人骨髓細(xì)胞，提取基因組DNA作為模板，擴(kuò)增pre-miR-196b，反應(yīng)條件為:94 ℃，3 min;94 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，30 s共30循環(huán);72℃，7 min。PCR產(chǎn)物切膠回收后和載體plVTHM分別用ClaⅠ和MluⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在Amp抗性篩選平板上挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并測(cè)序。

1.2.2 包裝慢病毒顆粒:接種293T細(xì)胞到10 cm培養(yǎng)皿中，采用 Lipofectamine 2000，共轉(zhuǎn)染 20 μg plVTHM-miR-196b、15 μg psPAX2 和 6 g pMD2.G。轉(zhuǎn)染48 h后，4℃，1 000×g離心10 min取病毒上清，并用0.45 μm濾器過(guò)濾，分裝至1.5 mL離心管，－80℃保存病毒液。

1.2.3 病毒滴度測(cè)定:接種K562細(xì)胞到96孔板中，加入不同濃度的病毒液進(jìn)行感染。設(shè)5個(gè)病毒濃度梯度組，每組加入不同量病毒液，分別為40、80、160、320 和 640 μL，設(shè) 2 個(gè)對(duì)照組，1 組加入終濃度5 mg/L的polybrene，1組為陰性對(duì)照。培養(yǎng)72 h后，用倒置顯微鏡觀察并紀(jì)錄每個(gè)濃度梯度中綠色熒光蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。根據(jù)病毒上清液體積、稀釋倍數(shù)、綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出病毒上清液的滴度:滴度={（%綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)〕×（第2天細(xì)胞數(shù)/mL）}/病毒量（mL）。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.2.4 感染并分選綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞:接種K562細(xì)胞到6孔板中，加入病毒液感染。24 h后，移去病毒上清稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，收集感染的細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分選綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-196b的表達(dá):采用Hairpin-itTMmicroRNA qPCR Quantitation Kit檢測(cè)miR-196b的表達(dá)，Q-miR-196b上下游引物混合物P3為:5'-GCAGCACGCTAGGTAGTTTCCTATCG TTGTTCTCCACTCCTTGAC-3'，內(nèi)參 Q-U6上下游引物混合物P4為:5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGA TTGGAACGCTTCACGAATTTG-3'，PCR反應(yīng)條件為:95 ℃，3 min;95 ℃，12 s，62 ℃，40 s，共40 循環(huán)。

1.2.6 細(xì)胞增殖檢測(cè):采用CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖水平，在96孔板接種K562細(xì)胞、plv空病毒細(xì)胞、過(guò)表達(dá)miR-196b細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，在450 nm測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒表達(dá)載體plVTHM-miR-196b的構(gòu)建及鑒定

pre-miR-196b的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小預(yù)計(jì)為284 bp（圖1），結(jié)果與預(yù)期一致。提取的質(zhì)粒酶切鑒定正確后（圖2），進(jìn)行測(cè)序。選擇測(cè)序正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，操作結(jié)果如下:

2.2 包裝病毒，滴度測(cè)定，分選綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞

由plVTHM-miR-196b包裝的病毒命名為196b病毒，由plVTHM包裝的病毒命名為plv病毒。病毒滴度測(cè)定為6×106TU/mL。不同濃度病毒液感染K562細(xì)胞的效率不同（圖3），最后選擇用160 μL病毒液/1 mL培養(yǎng)基感染細(xì)胞。感染后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分選綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，并擴(kuò)大培養(yǎng)，把196b病毒感染的細(xì)胞命名為過(guò)表達(dá)miR-196b細(xì)胞，把plv病毒感染的細(xì)胞命名為plv空病毒細(xì)胞。

圖1 pre-miR-196b的擴(kuò)增序列Fig 1 Pre-miR-196b amplification products

圖2 plVTHM-miR-196b酶切結(jié)果Fig 2 plVTHM-miR-196b digestion results

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-196b的表達(dá)水平

plv空病毒細(xì)胞和K562細(xì)胞中miR-196b的表達(dá)水平很低且基本一致，miR-196b細(xì)胞中miR-196b的表達(dá)水平明顯高于其他兩組（P＜0.05）（圖4）。

2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

K562細(xì)胞增殖 ＞plv空病毒細(xì)胞 ＞過(guò)表達(dá)miR-196b細(xì)胞（表1，圖5），過(guò)表達(dá) miR-196b細(xì)胞的增殖顯著慢于K562細(xì)胞和plv細(xì)胞（P＜0.05）。

3 討論

對(duì)于懸浮細(xì)胞K562來(lái)說(shuō)，可采用普通分化細(xì)胞常用的轉(zhuǎn)染方法，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后抗生素篩選，但該方法時(shí)間長(zhǎng)、效率低;也可使用電穿孔的方法，雖然效率高但對(duì)細(xì)胞損傷比較大。慢病毒載體系統(tǒng)具有對(duì)細(xì)胞毒性小、轉(zhuǎn)染效率高、可長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)等特點(diǎn)，因此我們選擇慢病毒載體系統(tǒng)，成功構(gòu)建了miR-196b慢病毒表達(dá)載體，并進(jìn)行病毒包裝和細(xì)胞感染，對(duì)感染的細(xì)胞檢測(cè)了miR-196b的表達(dá)水平，結(jié)果表明miR-196b在慢粒細(xì)胞K562中成功穩(wěn)定表達(dá)。

圖3 不同濃度病毒感染K562結(jié)果Fig 3 Different concentrations of virus infection of K562（×10）

圖4 不同細(xì)胞中miR-196b的表達(dá)水平Fig 4 miR-196b expression levels in different cells

表1 CCK-8法檢測(cè)不同細(xì)胞增殖的結(jié)果Table 1 The detection of different cells proliferation by CCK-8（±s，n=3）

表1 CCK-8法檢測(cè)不同細(xì)胞增殖的結(jié)果Table 1 The detection of different cells proliferation by CCK-8（±s，n=3）

*P ＜0.05 compared with K562;#P＜0.05 compared with plv.

day K562 cells plv cells cells overexpressed miR-196b 1 1.590±0.14 1.141±0.19 0.992±0.18 2 2.747±0.20 2.211±0.249 1.712±0.1864*3 5.214±0.19 4.086±0.155 3.101±0.117*#4 5.536±0.182 3.944±0.209 3.140±0.1419*#

圖5 CCK-8法檢測(cè)不同細(xì)胞的增殖結(jié)果Fig 5 The detection of different cells proliferation by CCK-8

我們又進(jìn)一步檢測(cè)了不同細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明K562細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-196b后，增殖水平顯著下降，提示miR-196b有抑制K562細(xì)胞增殖的作用。miR-196b的其他研究表明，miR-196b在不同的腫瘤細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞增殖的作用不同。Suman Bhatia等［8］的研究表明在B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞EB-3中miR-196b有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用;How C等［12］研究表明，在子宮頸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-196b可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、集落生成，遷移和侵襲;有研究表明［13］，miR-196b可以抑制異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡。還有研究表明［14］在胃癌細(xì)胞中 miR-196b有促進(jìn)細(xì)胞增殖、提高生存率的作用;研究表明［15］miR-196b可以促進(jìn)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖，并導(dǎo)致不良預(yù)后。因此各細(xì)胞系中miR-196b對(duì)增殖的作用并不相同，miR-196b在K562中的抑制增殖作用還需進(jìn)一步研究。

總之，上述結(jié)果為今后研究miR-196b在慢粒中的作用機(jī)制和功能提供了依據(jù)。

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