徐顥溪

（安徽職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系，安徽 合肥 230000）

超氧化物歧化酶綜合利用研究進(jìn)展

徐顥溪

（安徽職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系，安徽 合肥 230000）

超氧化合物歧化酶通過專一催化超氧陰離子自由基歧化反應(yīng)，有效防御生物體內(nèi)活潑氧對機(jī)體的傷害。對超氧化合物歧化酶的分類、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、催化機(jī)理與活性以及其在食品工業(yè)、日用化工、醫(yī)藥等方面的綜合利用進(jìn)行了闡述，并展望了其發(fā)展趨勢。

超氧化合物歧化酶；超氧陰離子自由基；活性；應(yīng)用

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員，廣泛分布在微生物、植物和動物體內(nèi)。該酶首次由Mann和Keilin[1]于1938年從牛紅細(xì)胞中分離提純而獲得，全酶由酶蛋白和金屬輔助因子構(gòu)成，通過專一催化超氧陰離子自由基（O-2·）產(chǎn)生歧化反應(yīng)而清除超氧陰離子自由基，從而防御生物體內(nèi)氧中毒，現(xiàn)今許多研究證明，當(dāng)生物體內(nèi)由于氧氣的存在而產(chǎn)生過多自由基或機(jī)體過慢清除自由基時，自由基由于其過于活潑的化學(xué)反應(yīng)活性，會和生物機(jī)體內(nèi)的生物大分子進(jìn)行反應(yīng)，使生物大分子發(fā)生功能性根本改變，如堿基突變、DNA斷裂、蛋白質(zhì)損傷或膜脂過氧化等，致使機(jī)體組織器官、機(jī)體細(xì)胞及分子水平層面造成不同程度損傷，不僅會誘發(fā)生物體內(nèi)各種疾病，更會導(dǎo)致生物機(jī)體衰老加速。因此，對SOD此類“自由基清道夫”的研究及綜合利用具備其重要價值和意義。筆者從SOD性質(zhì)、催化機(jī)理與活性及SOD綜合利用方面進(jìn)行綜述，并展望其發(fā)展趨勢，旨在為SOD的科學(xué)利用提供借鑒。

1 SOD分類、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

迄今為止，根據(jù)SOD分子活性部位所含金屬輔助因子的不同，主要將其分為Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD 3種類型。

1.1 Cu/Zn-SOD

Cu/Zn-SOD呈藍(lán)綠色，相對分子質(zhì)量約為32000，主要分布于真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、葉綠體基質(zhì)和過氧化物酶體中[2-3]。

Cu/Zn-SOD的空間結(jié)構(gòu)最初于1975年由Richardson通過0.2 nm X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析獲得。Cu/Zn-SOD分子是由疏水次級鍵作用將2個各含1個Zn2+和1個Cu2+的基本相同亞基結(jié)合成的狀如“口袋”的蛋白二聚體，肽鏈內(nèi)部由2個半胱氨酸Cys-55和Cys-144的巰基結(jié)合形成的唯一的二硫橋?qū)Χ垠w四級結(jié)構(gòu)的形成及穩(wěn)定發(fā)揮了重要作用。分子中通過一個組氨酸（His-61）共同連接而使Cu2+、Zn2+相連的“咪唑橋”，構(gòu)成Cu/Zn-SOD的活性部位。相距約0.63 nm的Cu2+和Zn2+處在“口袋”底部，Cu2+與相鄰4個組氨酸殘基（（His-44，-46，-61，-118）咪唑氮配位及與其相鄰的水分子形成一畸變正方錐構(gòu)型，而Zn2+更與其相鄰3個組氨酸殘基（His-61，-69，-78）咪唑氮以及1個天冬門氨酸殘基（Asp-81）羧基氧配位形成一畸變四面體構(gòu)型。通過“咪唑橋”將畸變正方錐構(gòu)型和畸變四面體構(gòu)型緊密相連[4]。Cu/Zn-SOD分子內(nèi)部含有較高程度的β折疊，而α螺旋則較少。

1.2 Fe-SOD

Fe-SOD呈黃褐色，由2個或4個各含0.5～1.0個Fe3+的亞基構(gòu)成[5]，其亞基相對分子質(zhì)量約為23 000，常見于原核細(xì)胞及少數(shù)植物細(xì)胞中。

1.3 Mn-SOD

Mn-SOD呈紫紅色，常見于原核生物細(xì)胞及線粒體中。原核細(xì)胞中的Mn-SOD是由2個各含有0.5～1.0個Mn2+的亞基構(gòu)成，而來自真核細(xì)胞線粒體中的Mn-SOD，則是由4個亞基構(gòu)成。其亞基相對分子質(zhì)量約為23 000。

Fe-SOD與Mn-SOD的空間結(jié)構(gòu)相對Cu/Zn-SOD簡單，且兩者類似，而且與Cu/Zn-SOD不同，含β折疊很少，主要成分是α螺旋。每個亞基中圍繞活性部位金屬離子的都是與3個組氨酸殘基及1個天門冬氨酸殘基的羧基氧以及與1個水分子配位，形成畸變正方錐構(gòu)型。第90位氨基酸殘基在Fe-SOD中為酪氨酸，而在Mn-SOD中則為苯丙氨酸，兩者都圍繞活性部位，作用也相似。在一級結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)e-SOD與Mn-SOD同樣存在不同的差異氨基酸。因此，F(xiàn)e-SOD和Mn-SOD盡管在氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)上以及分子量、蛋白質(zhì)氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)、紫外吸收光譜以及對不同抑制劑的敏感等方面性質(zhì)都呈現(xiàn)了相當(dāng)?shù)南嗨菩?，與Cu/Zn-SOD差別較大，但相互之間畢竟還存在少許區(qū)別[6]。

除此之外，自然界還存在著如只存在于某些極少數(shù)原核細(xì)菌中的Fe/Zn—SOD、Ni-SOD等其他少見SOD。

2 SOD催化機(jī)理與活性

2.1 SOD的催化機(jī)理

超氧陰離子自由基作為SOD的唯一作用底物，除帶有1個未成對電子的同時，還帶有1個負(fù)電荷，屬于化學(xué)性質(zhì)活潑的活性氧（Active Oxygen Species，AOS）類群。首先,SOD催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，初始狀態(tài)為氧化態(tài)的SOD將1分子O-2·氧化成氧氣（O2），產(chǎn)生質(zhì)子化反應(yīng)，然后被還原的SOD又將1分子O-2·還原為過氧化氫，同時SOD又被氧化為初始氧化態(tài)的SOD。最后，H2O2在過氧化氫酶的作用下，被催化分解為水（H2O）和O2。SOD的催化作用是通過酶活性部位的金屬輔助因子在氧化還原反應(yīng)的過程中得失電子而實(shí)現(xiàn)。

2.2 SOD的活性影響因子

SOD屬于酸性蛋白酶類，相對于一般酶類對于溫度、pH以及蛋白酶類對其水解等穩(wěn)定，但其催化效率與催化活性仍與其含量和反應(yīng)環(huán)境相關(guān)。以Cu/Zn-SOD為例，主要與理化環(huán)境使其活性部位的金屬離子、氨基酸殘基以及配位環(huán)境，同時還與“咪唑橋”等的變化相關(guān)[7]。

SOD活性部位的不同金屬輔助因子對酶催化活性的影響各異。Cu2+在Cu/Zn-SOD活性保持上占據(jù)重要位置，首先，結(jié)合態(tài)Cu2+起電子傳遞作用，與酶的催化活性直接相關(guān)，另外，一定范圍內(nèi)的游離態(tài)Cu2+的加入，可以大幅度提高SOD的催化活性。若去除SOD酶分子中的Cu2+，SOD將完全失活，重加Cu2+即SOD復(fù)活。而Zn2+則與保持酶活性部位穩(wěn)定構(gòu)象相關(guān)，并起調(diào)節(jié)Cu2+與咪唑基關(guān)系的作用。若去除Zn2+并保留SOD酶分子中的Cu2+時，酶分子仍然保持高度的活度值。

處于酶分子活性部位的，對SOD催化活性占有重要地位的2種氨基酸殘基是組氨酸（His）和精氨酸（Arg）。這2種氨基酸殘基均攜帶正電荷，并靠近活性部位的金屬輔助因子，可誘導(dǎo)底物順利進(jìn)入SOD活性部位，并在催化反應(yīng)的過程中提供質(zhì)子，加快反應(yīng)速度。若去除或修飾此2種氨基酸，將會使SOD完全失活。

而“咪唑橋”在催化反應(yīng)中，當(dāng)在與Cu2+相連咪唑氮快速發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化變化時，SOD酶分子的催化活性會受到重大影響。

2.3 SOD活性檢測

多種生化測量方法可檢測SOD的歧化反應(yīng)催化活性，主要有如鄰苯三酚自氧化法、化學(xué)發(fā)光法以及黃嘌呤氧化酶-細(xì)胞色素C法等[8-10]。

鄰苯三酚自氧化法是現(xiàn)今使用最為普遍的高靈敏度SOD活性檢測法，該法步驟簡單，使用方便，所使用的儀器及試劑也較為常見。在堿性環(huán)境中，鄰苯三酚可發(fā)生的自氧化反應(yīng)而產(chǎn)生O-2·，而當(dāng)SOD存在時，鄰苯三酚自氧化反應(yīng)被抑制，反應(yīng)速度減緩，可通過吸光度變化的測定確定SOD活性。但該法對環(huán)境條件要求較高（如pH、溫度、底物濃度等），在檢測時需嚴(yán)格控制。

化學(xué)發(fā)光法具備高靈敏度、高精確度、強(qiáng)專一性及檢測快速等優(yōu)點(diǎn)，但因需要特殊高靈敏度的精密發(fā)光檢測儀器，故在臨床使用方面受到抑制。該法的檢測原理為：在有氧存在時，黃嘌呤及次黃嘌呤通過黃嘌呤氧化酶催化生成尿酸和O-2·，以魯米諾或?，摤摴馑卣T導(dǎo)劑為發(fā)光劑，根據(jù)SOD對發(fā)光的抑制程度來測定SOD活性。

黃嘌呤氧化酶-細(xì)胞色素C法又稱Mccovd法，是最早利用的一種經(jīng)典的SOD活性檢測法。該法基于在有氧存在時，黃嘌呤被黃嘌呤氧化酶催化氧化生成尿酸與O-2·，同時將O-2·氧化型細(xì)胞色素C還原為在550 nm處有最大吸收的還原型細(xì)胞色素C。而當(dāng)加入SOD后，O-2·被SOD催化發(fā)生歧化，同時降低細(xì)胞色素C還原反應(yīng)速率。可利用加入SOD前后，細(xì)胞色素C還原反應(yīng)速率的變化而測定SOD活性。為提高該法靈敏度，可將細(xì)胞色素C用乙酰細(xì)胞色素C替代，緩沖液由pH 7.8的磷酸鹽換為pH 10.2的碳酸鹽溶液。

除此之外，SOD活性檢測方法還有如羥胺發(fā)色法、光化學(xué)擴(kuò)增法、氮藍(lán)四唑法、極譜氧電極法、化學(xué)發(fā)光免疫測定法等[11]。

3 SOD的綜合利用

3.1 SOD在食品工業(yè)中的綜合利用

SOD因其專一抗氧化性及其獨(dú)特生理功能，在食品工業(yè)中得以廣泛應(yīng)用[12]。SOD在蔬菜水果中含量較高，如香蕉、山楂、刺梨、獼猴桃、大蒜等，其他如扇貝、雞肉等中也有分布。SOD的活性在果皮中高于果肉，在新鮮水果中高于放置后的水果。并以各種形式被加工成保健品和食品添加劑等作為使用。如添加有SOD的牛奶、啤酒、軟糖等類型的食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑[13]；也因其抗氧化性抵御食品腐敗或變質(zhì)等現(xiàn)象，可作為如罐頭、果汁飲料等的食品抗氧化劑或蔬菜水果的保鮮劑使用；如直接研制的SOD片劑、口服液、膠囊等多種劑型的SOD保健食品；如用富含SOD的食物加工而成的保健品等。

3.2 SOD在日化工業(yè)中的應(yīng)用

皮膚衰老和損傷是人體衰老的重要特征，而人體衰老是由于活性氧類自由基堆積或清除產(chǎn)生障礙的后果，體內(nèi)的多余自由基會引起細(xì)胞損傷以及色素沉著。由于人的皮膚直接與氧氣接觸，會造成皮膚的老化和損傷。外源SOD的補(bǔ)充有利于延緩皮膚衰老、抗氧化、祛色斑的功用。故國內(nèi)外許多化妝品廠家都在自身產(chǎn)品中加入了一定比例的SOD。如法國的雅詩蘭黛石榴水、日本的SKII神仙水，以及國內(nèi)大寶SOD蜜等。

3.3 SOD在醫(yī)藥中的應(yīng)用

基于SOD是作用于O-2·的專一歧化反應(yīng)催化劑，故SOD作為醫(yī)藥產(chǎn)品，在治療因自由基作用而導(dǎo)致的炎癥、自身免疫性、心腦血管疾病等都有著顯著療效[14]。

炎癥是生物機(jī)體受外界病菌入侵后的自我保護(hù)作用，其中其重要作用的吞噬細(xì)胞在此過程中大量消耗氧氣，產(chǎn)生大量活性氧自由基，直接攻擊機(jī)體中的生物大分子及細(xì)胞，吞噬細(xì)胞本身也被自由基所傷。SOD可利用其抗氧化作用抑制關(guān)節(jié)炎、胸膜炎、急性氣管炎等炎癥類型[15]。

研究表明，自身免疫性疾病的發(fā)病歷程可通過SOD或其他氧自由基清除劑抑制[16]。如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)SOD含量遠(yuǎn)小于正常值，而紅斑狼瘡患者的血清中因O-2·的存在出現(xiàn)一種可破壞染色體的介裂因子，故SOD類藥物可用于治療此類自身免疫性疾病。

SOD還引起抗氧化作用，可調(diào)節(jié)血脂濃度，降低脂類過氧化物含量，預(yù)防動脈粥樣硬化，故可預(yù)防或治療因高血脂而引起的如心肌梗塞等心腦血管類疾病[17]。

此外，SOD對治療如輻射病、早產(chǎn)兒呼吸窘迫綜合癥、膠原病、肺氣腫等疾病，及預(yù)防腫瘤等也有顯著療效。

4 SOD發(fā)展趨勢

由于SOD天生專一抗氧化活性和自身結(jié)構(gòu)性質(zhì)的限制。目前，國內(nèi)外專家對SOD性能的完善及改造研究始終是熱門課題，主要集中在諸如SOD的模擬、結(jié)構(gòu)性能的改造以及植物抗逆性等[18-19]的研究方面，不同程度上取得了成果。同時SOD在食品工業(yè)、日化工業(yè)以及醫(yī)藥業(yè)等方面占據(jù)了重要地位。但依舊存在著尚未解決的問題，如活性檢測上的混亂、外源性SOD吸收性的質(zhì)疑、更富穩(wěn)定性的SOD模擬物的規(guī)模性生產(chǎn)[20-21]等，都是未來對于SOD研究的重點(diǎn)。

[1]MANN T，KEILIN D.Haemocuprein and hepatocuprein，copperprotein compounds of blood and liver in mammals[J].Proc R Soc B，1938（126）：303-315.

[2]章軼鋒，唐善虎，秦文玲，等.銅鋅超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展[J].四川畜牧獸醫(yī)，2008，35（1）：33-35.

[3]McBRIDEJA，PARADRB，DAVISJM，etal.Economic evaluationofrecombinanthumancopperzincsuperoxide dismutaseadministeredatbirthtoprematureinfants[J].J Perinatol，2009，29（5）：364-371.

[4]鄧一兵，楊體強(qiáng).應(yīng)用紅外光譜研究電場對超氧化物歧化酶二級結(jié)構(gòu)的影響[J].光譜學(xué)與光譜分析，2007，27（7）：1312-1315.

[5]劉曉紅，劉小蘭，岳俊杰，等.鐵超氧化物歧化酶活性中心結(jié)構(gòu)研究[J].結(jié)構(gòu)化學(xué)，2004，（3）：312-315.

[6]劉小蘭，劉曉紅，張欣，等.MnSOD與FeSOD的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理研究進(jìn)展[J].有機(jī)化學(xué)，2003，23（1）：30-36.

[7]嚴(yán)萬里，陳曉明，郭麗燕，等.超氧化物歧化酶活性測定的影響因素研究[J].生物學(xué)通報，2011，46（3）：50-53.

[8]黎瑞珍，楊慶建，陳貽銳.超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定及其應(yīng)用研究[J].瓊州大學(xué)學(xué)報，2004，11（5）：34-36.

[9]DIEHL C，LIPOZENCID J，LEDI6一DRVAR D.The basis of topicalsuperoxidedismutaseantipruriticactivity[J].Aeta Dermatovenerol Croat，2009，l7（1）：25-39．

[10]崔寶秋，趙東霞，楊忠志.應(yīng)用原子-鍵電負(fù)性均衡方法預(yù)測超氧化物歧化酶催化反應(yīng)的活性部位[J].化學(xué)學(xué)報，2007，65（23）：2687-2692.

[11]董亮，何永志，王遠(yuǎn)亮，等.超氧化物歧化酶的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2013，15（5）.53-58

[12]路玉蘭.超氧化物歧化酶在啤酒生產(chǎn)過程中的研究及應(yīng)用[J].中國食品添加劑，2011（4）：163-166.

[13]何獻(xiàn)君，梁曉冬，呂曉峰，等.超氧化物歧化酶應(yīng)用研究狀態(tài)[J].中國醫(yī)藥指南，2010，8（15）：37-39.

[14]朱秀敏.超氧化物歧化酶的生理活性[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2011，17（15）：26-27.

[15]陳勉，朱希強(qiáng).超氧化物歧化酶在醫(yī)藥臨床上的研究和應(yīng)用[J].食品與藥品.2009，11（9）：44-47.

[16]劉蓮，蔣紅梅，費(fèi)櫻，等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清超氧化物歧化酶和血管性血友病因子水平變化及意義[J].中國全科醫(yī)學(xué).2014（23）：2751-2753.

[17]辛續(xù)麗，楊桂花，胡梅，等.高脂血癥人群血清超氧化物歧化酶的變化趨勢[J].標(biāo)記免疫分析與臨床.2013，20（4）：225-228.

[18]史春艷，左夏林，丁宇，等.超氧化物歧化酶修飾改造的研究進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志.2009，29（13）.1723-1725.

[19]趙有璽，冀頤之，張慧娟，等.超氧化物歧化酶微膠囊的制備及微囊結(jié)構(gòu)的表征[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，（12）：3483-3485.

[20]李晨，楊征，厙夢堯，等.超氧化物歧化酶化學(xué)模擬的新進(jìn)展[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2011，32（9）：2046-2061.

[21]林慶斌，廖升榮，熊亞紅，等.超氧化物歧化酶（SOD）的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J].化學(xué)世界，2006，47（6）：378-381.

（責(zé)任編輯 張楊林）

Research Progress on Comprehensive Utilization of Superoxide Dismutase

XU Hao-xi(Department of Chemical Engineering,Anhui Vocational and Technical College,Hefei,Anhui 230000)

Superoxide dismutase effective prevented active oxygen in vivo damaged to the body,by exclusive catalysis on disproportionation reaction of superoxide anion radicals.The classification,structure,properties, catalytic mechanism and activity and the utilization in the food industry,daily chemical industry, pharmaceutical and others of superoxide sismutase were described in detail.Moreover,the development trends were prospected.

Superoxide dismutase;Superoxide anion radicals;Activity;Utilization

Q544

A

2095-0896（2014）08-059-04

徐顥溪（1981-），女，安徽廬江人，講師，碩士，從事生物化工研究。

2014-07-05