袁 媛(綜述)，張 鳳(審校)

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004)

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，其受細胞內(nèi)源性基因、酶類及信號轉(zhuǎn)導途徑的調(diào)控。細胞凋亡不是病理狀態(tài)下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動采取的一種死亡過程。細胞凋亡是多細胞有機體生長發(fā)育、細胞分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及生理和病理性死亡的重要機制，對機體有十分重要的意義。作為血液中的重要成分，血小板在止血、調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移及炎性反應等方面發(fā)揮重要作用，而血小板凋亡對血小板功能有重要影響。

1 血小板凋亡概述

1997年，Vanags等[1]研究發(fā)現(xiàn)無核血小板亦可發(fā)生凋亡。血小板沒有細胞核，但其含有有核細胞凋亡所需的多種蛋白，并且其線粒體及核糖體使其具有一定的蛋白質(zhì)合成能力。通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平及活性的變化，血小板可自主調(diào)控應對外界刺激。

細胞凋亡過程可分為開始階段及效應階段。開始階段包括死亡受體通路介導的外始式途徑及線粒體通路介導的內(nèi)始式途徑。一旦被激活，兩條通路就會發(fā)揮協(xié)同作用，激活胱天蛋白酶(caspase)家族進入效應階段，導致細胞的程序性死亡，最終細胞被破壞和吞噬。研究發(fā)現(xiàn)[2]，血小板凋亡也可分為內(nèi)始式途徑及外始式途徑，其中，內(nèi)始式途徑在血小板凋亡中起主要調(diào)控作用。外始式途徑仍不太清楚，需要進一步研究。

2 血小板凋亡的誘導因素

目前已知的血小板凋亡的誘導因素包括生理性及病理性刺激因素。研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的凝血酶通過蛋白酶激活受體介導血小板凋亡[3]。部分促血小板活化的因子，如血小板膜糖蛋白GPⅠbα等也可促血小板凋亡[4]。血漿中血管性血友病因子與血小板膜糖蛋白GPⅠbα受體的相互作用可促使血小板凋亡。其他還包括病理性的高血流剪切力[5]、膠原、花生四烯酸、腺苷二磷酸、腺苷酸二磷酸[6]、白藜蘆醇[7]、鈣離子載體A23187、血栓素類似物U46619和血小板儲存條件[8]等。研究發(fā)現(xiàn)[2]，病理性的血管高剪切力及A23187誘導血小板凋亡的作用較強，而凝血酶、腺苷二磷酸、花生四烯酸、膠原等誘導血小板凋亡的能力相對較弱?？梢?，生理性刺激劑誘導血小板凋亡的作用明顯弱于化學制劑等非生理性刺激因素。

3 血小板凋亡的內(nèi)始式途徑

多項研究證實，化學誘導劑通過內(nèi)始式途徑(即線粒體途徑)引起血小板凋亡，主要包括以下過程：①線粒體跨膜電位(mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm)去極化，這是凋亡的早期表現(xiàn)及特征性改變；②線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔形成，而后有多種線粒體蛋白轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)發(fā)揮調(diào)控血小板凋亡的作用；③凋亡前蛋白(Bax、Bak及Bid)表達、活化并易位至線粒體；④線粒體膜間隙釋放細胞色素C至胞質(zhì)；⑤caspase-9活化[2]。部分化學刺激還可引起線粒體外部下游變化，如caspase-3活化、鈣結(jié)合微絲蛋白gelsolin裂解、血小板膜表面磷脂酰絲氨酸外翻表達、血小板皺縮及血小板微粒脫落。有研究表明，白藜蘆醇(resveratrol)引起caspase-8活化導致血小板發(fā)生凋亡[7]。

4 血小板凋亡的執(zhí)行

4.1caspase家族 caspase平常以酶原形式存在，活化后可特異性地切斷天冬氨酸殘基后的肽鍵。caspase家族分為兩類：一類為起始者，在接受到信號后可通過自剪接或自催化的方式激活，引起caspase級聯(lián)反應；另一類為執(zhí)行者，引起胞內(nèi)的結(jié)構蛋白及功能蛋白降解。兩者之間存在著“上下游”關系。多數(shù)血小板凋亡誘導劑都能促使血小板內(nèi)caspase-3等活化，而抑制caspase-3則可逆轉(zhuǎn)血小板凋亡。然而也有研究顯示，血小板會發(fā)生caspase-3非依賴的凋亡[9]。鈣依賴中性蛋白酶(calpain)酶切caspase-3的活化位點，使其活化受到抑制，而calpain替代caspase-3降解細胞內(nèi)相應蛋白。兩者在血小板凋亡中的獨立或協(xié)同作用機制還需進一步研究。

4.2calpain 研究表明，calpain抑制劑可阻止A23187等刺激劑誘導的血小板凋亡，而calpain激活劑直接激活calpain就可誘導血小板凋亡[10]，說明calpain參與調(diào)控血小板的凋亡。然而有研究顯示[11]，calpain抑制劑calpeptin可明顯抑制血小板微顆粒的釋放及部分蛋白發(fā)生降解，但不能影響線粒體膜電位的下降、caspase-3活化及磷脂酰絲氨酸外翻。該研究由此推斷，在血小板凋亡中可能存在calpain依賴及calpain非依賴的兩條信號通路，兩者分別依賴不同的誘因，或者兩者同時發(fā)揮作用[11]。

4.3細胞骨架蛋白 細胞骨架蛋白不僅在參與細胞運動、維持細胞形態(tài)及調(diào)節(jié)細胞通道蛋白的功能等方面發(fā)揮關鍵作用，還是細胞內(nèi)多種調(diào)節(jié)信號的中介體。研究顯示，在血小板凋亡過程中，活化的calpain及caspase-3可裂解細胞骨架蛋白，影響血小板內(nèi)部結(jié)構的有序性，進而導致凋亡[10]。

4.4微顆粒釋放及血小板皺縮 血小板凋亡可引起細胞膜上磷脂酰絲氨酸外翻，還會使細胞膜形成囊泡，釋放血小板微顆粒[12]。通過電鏡觀察或流式細胞儀可檢測到血小板微顆粒釋放及血小板皺縮，兩者是血小板凋亡的形態(tài)學表現(xiàn)。血小板活化時釋放的微顆粒具有高促凝活性，但目前還不清楚其凋亡時釋放的微顆粒成分。

此外，在血小板凋亡進程中也可檢測到細胞色素C及凋亡酶激活因子1[10,13]等，其參與血小板凋亡的機制還需進一步研究。

5 血小板凋亡的調(diào)控

血小板凋亡是十分復雜的生物過程，有多種重要的生物分子參與其中。同時，血小板凋亡受到多種調(diào)節(jié)因素的調(diào)控，抗凋亡因子和促凋亡因子的共同調(diào)節(jié)使血小板凋亡得以按程序性進行。

5.1B細胞淋巴瘤/白血病2家族 B細胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族按照功能可分為促凋亡蛋白(Bak、Bax等)及抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-x等)兩類[14]。兩者在內(nèi)始式途徑調(diào)控血小板凋亡過程中發(fā)揮重要作用。促凋亡蛋白平時以非活性形式分布于胞質(zhì)，當誘導凋亡因素刺激血小板后，其會在某些蛋白酶的作用下從胞液易位到線粒體外膜上，并且其在胞內(nèi)的濃度亦增加，打破了Bcl-2家族抗凋亡蛋白及促凋亡蛋白之間的平衡，使得抗凋亡蛋白喪失抑制活性，同時伴隨發(fā)生血小板線粒體的功能障礙，最終導致血小板凋亡[15]。

1997年，Vanags等[1]首次報道了血小板內(nèi)存在Bcl-2家族成員。直到2007年，有學者利用Bcl-2家族基因敲除的小鼠研究血小板凋亡，明確了抗凋亡蛋白Bcl-x是血小板存活的關鍵調(diào)控蛋白[15]。Bcl-x和促凋亡蛋白Bax以類似“開關”的方式調(diào)控血小板的存活：當Bcl-x降解導致胞內(nèi)水平下降時，血小板會通過Bak的作用凋亡，使用Bcl-x的抑制劑的體外實驗可觀察到血小板凋亡現(xiàn)象，體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)動物體循環(huán)中血小板數(shù)量明顯下降[15]。此外，Bak/Bax的基因剔除小鼠對誘導凋亡試劑有明顯的抵抗性，證實凋亡的發(fā)生依賴于血小板內(nèi)的Bak及Bax。但與有核細胞不同，血小板內(nèi)含有一個BH(Bcl-2 homology)同源結(jié)構域(BH3-only亞家族成員Bim及Bid)，不能激活Bax，在內(nèi)始式途徑介導的血小板凋亡中不發(fā)揮作用[16]。Bcl-2家族能在線粒體膜上形成類似于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的孔洞，直接誘導線粒體膜電位下降。Bcl-2家族或線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔可能獨自或協(xié)同發(fā)揮作用，參與調(diào)控血小板ΔΨm的下降。這些調(diào)控機制還需進一步研究。

5.2鈣離子 鈣離子在血小板凋亡中的作用取決于刺激劑的種類。新型抗癌因子BH3模擬分子ABT-737可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族中的Bax或Bak的作用誘導細胞凋亡。研究表明，鈣離子可能不參與ABT-737誘導的血小板凋亡[17]，但其在鈣調(diào)蛋白抑制劑誘導的血小板凋亡中則起重要調(diào)控作用[18]。

6 研究血小板凋亡的意義

血小板凋亡與機體的多種生理功能及病理過程密切相關。凋亡可能是血小板在體內(nèi)清除的重要途徑之一。在病理情況下，血小板凋亡可引起機體凝血異常。研究顯示，血小板凋亡及功能異常可能是高熱患者出血的原因之一[19]，也可能是他莫西芬等抗癌藥導致出血的原因[16]。Sener等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥患者的血小板凋亡及活化同時發(fā)生使其發(fā)生動脈血栓形成性腦梗死的可能性升高。Sobol等[21]研究發(fā)現(xiàn)，行血透的尿毒癥患者存在血小板凋亡。此外，研究發(fā)現(xiàn)凋亡可能是導致庫存血小板失活的重要因素[7]。

7 展 望

目前，對細胞凋亡的研究不斷深入，其檢測指標更加明確。隨著多種檢測試劑盒的應用，對細胞凋亡的檢測手段更加豐富，檢測方法更簡便靈敏。作為血小板研究領域的重要組成部分，血小板凋亡的研究將為延長血小板保存時間以及血栓與出血性疾病的防治等方面提供理論依據(jù)。血小板凋亡的研究成果有可能提高相關疾病的診療水平或應用于指導新藥設計。因此可以預測，對血小板凋亡的研究會有廣闊的前景。

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