陳江川CHEN Jiangchuan

劉永亮1LIU Yongliang

劉 政2LIU Zheng

葉 鋼1YE Gang

易善紅1YI Shanhong

低功率超聲輻照微泡造影劑對大鼠前列腺內(nèi)伊文思藍濃度的影響

陳江川1CHEN Jiangchuan

劉永亮1LIU Yongliang

劉 政2LIU Zheng

葉 鋼1YE Gang

易善紅1YI Shanhong

目的探討低功率超聲輻照微泡造影劑提高前列腺內(nèi)的藥物濃度的價值。材料與方法選取成年遠(yuǎn)交群（SD）雄性大鼠60只，按抽簽法分為對照組、伊文思藍（EB）組、微泡組、同時輻照組及先行輻照組，每組各12只。對照組給予生理鹽水10 ml/kg；EB組給予EB 50 mg/kg；微泡組給予微泡造影劑0.1 ml/kg；同時輻照組先給予EB 50 mg/kg，超聲輻照5 min后，再給予微泡造影劑0.1 ml/kg；先行輻照組給予微泡造影劑0.1 ml/kg后，超聲局部間歇輻照前列腺5 min，30 min再給予EB 50 mg/kg。實驗結(jié)束后取前列腺組織進行病理觀察，并制備前列腺組織勻漿測量EB濃度。結(jié)果EB組大鼠前列腺內(nèi)EB濃度高于對照組及微泡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.157、4.357, P＜0.01）；同時輻照組大鼠前列腺內(nèi)EB濃度高于EB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.438, P＜0.05）；先行輻照組大鼠前列腺內(nèi)EB濃度明顯低于同時輻照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.761, P＜0.05）；先行輻照組與EB組EB濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.684, P＞0.05）。結(jié)論低功率超聲聯(lián)合微泡造影劑可以明顯提高前列腺組織EB藥物濃度。

前列腺；超聲檢查；造影劑；微泡；伊文思藍；模型，動物；大鼠

前列腺炎是我國發(fā)病率較高的男性生殖系統(tǒng)感染性疾病之一，占泌尿外科男性門診疾病的25%～30%，且發(fā)病率有上升趨勢[1]。臨床對前列腺炎的治療以藥物治療為主，但是血-前列腺屏障使常規(guī)的藥物較難在前列腺內(nèi)達到有效治療濃度，影響其臨床效果[2]。超聲空化效應(yīng)可以使細(xì)胞膜通透性增高[3]。超聲微泡造影劑作為攜帶藥物或治療性基因的載體，可以強化超聲空化效應(yīng)[4]。本研究利用低劑量超聲聯(lián)合微泡造影劑提高前列腺細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，為超聲微泡應(yīng)用于慢性前列腺炎的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 成年遠(yuǎn)交群（sprague dawley, SD）大鼠60只，雄性，清潔級，體重350～450 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供。采用抽簽法分為對照組、伊文思藍（EB）組、微泡組、同時輻照組、先行輻照組5組，每組各12只。EB購自南京美瑞制藥有限公司。低功率超聲治療儀由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院超聲科自行研制。脂氟顯脂質(zhì)微泡由實驗室自行研制，外觀為乳白色凝乳狀微泡懸浮液，核心氣體為全氟丙烷，微泡濃度約為1×107/ml，平均粒徑2 μm。采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，劑量1 ml/kg，戊巴比妥鈉購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 動物模型的建立 將EB用蒸餾水溶解為2%的過濾滅菌溶液后注射給藥。對照組經(jīng)鼠尾靜脈注射生理鹽水10 ml/kg；EB組經(jīng)鼠尾靜脈注射EB 50 mg/kg；微泡組經(jīng)鼠尾靜脈注射微泡造影劑0.1 ml/kg；同時輻照組先經(jīng)鼠尾靜脈注射EB 50 mg/kg，5 min后注射微泡造影劑0.1 ml/kg，而后行超聲輻照干預(yù)實驗；先行輻照組先經(jīng)鼠尾靜脈注射微泡造影劑0.1 ml/kg，間歇輻照前列腺局部5 min，30 min后注射EB 50 mg/kg。

1.3 超聲檢查 采用第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院超聲科自行研制的超聲診斷儀，探頭頻率1.2 MHz。以大鼠下腹部區(qū)域為聲窗，待屏幕中顯示大鼠前列腺影像后固定超聲切面。輻照時間均為5 min，峰值負(fù)壓為4.5 MPa，發(fā)射占空比為0.37%，平均聲強0.4 W/cm。1.4 病理檢查 在治療結(jié)束6 h后開胸，自主動脈灌注生理鹽水沖洗，壓力為100～120 cmH2O（100 cm H2O=9.8 kPa），直至從剪開的大鼠右心房內(nèi)流出的液體為無色。隨即開腹取出前列腺組織，以10%福爾馬林溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，并用HE染色，每個標(biāo)本切6張切片，切片厚度為5 μm，光鏡下觀察大鼠的前列腺組織。

1.5 前列腺組織中EB含量的測定 在實驗結(jié)束6 h后處死大鼠，取出大鼠前列腺，將其重后切成小塊置于10 ml的甲酰胺溶液中，置于37℃恒溫水浴箱中24 h，以萃取樣本中的EB，并用DU800紫外分光光度計測定625 nm波長處光密度值。

1.6 藥品對照溶液、前列腺組織勻漿的制備及對照溶液反應(yīng)值（As）的測定 用電子天平稱定EB原藥50 mg，置于50 ml量瓶中，加氯仿溶解并稀釋搖勻，精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml，分別置10 ml量瓶中，加入氯仿定容成約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/ ml的溶液作為藥品對照溶液。在無菌條件下，用無菌組織剪剪碎大鼠前列腺，每樣本稱取0.300 g，分別置于50 ml離心管，分次加入共20 ml的6%高氯酸溶液，使用組織勻漿機進行標(biāo)本勻漿。勻漿完成后將樣本以9000 r/min離心10 min，加15%三氯乙酸4 ml沉淀樣本中的蛋白，過濾在容量為100 ml的三角燒瓶中。將離心后的沉淀物用15 ml 6%高氯酸再次進行勻漿、離心處理，離心后加入4 ml的15%三氯乙酸沉淀樣本中的蛋白并過濾，將2次所得上清液合并，用5.0、0.5 mol/L NaOH調(diào)配成pH=6.5的溶液，并轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，定容搖勻。吸取醋酐2 ml置于具塞試管中，再加10 μl硫酸后，立即加入約0.2 mg/ml藥品對照溶液1 ml，置振蕩器中混勻，再倒入比色池中反應(yīng)，并同時于625 nm波長處觀察其反應(yīng)的吸收度變化情況，記錄最大吸收度As，其中以1 ml氯仿代替上述反應(yīng)中的對照品溶液，作為空白對照。

1.7 前列腺組織勻漿溶液反應(yīng)值（At）的測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 加入前列腺組織勻漿1 ml代替上述As測定中的藥品對照溶液，同法操作，記錄最大吸收度At。以2 ml氯仿代替其中的醋酐同法操作，作為空白對照。測定后，按比色法原理計算出前列腺中EB的含量及濃度。以5 mg/ml EB溶液作為初始濃度進行倍比稀釋，形成梯度濃度為5、2.5、1.25、0.625、0.3275、0.15675 mg/ml的EB溶液，精密吸取各溶液1 ml，按At測定方法進行操作。

1.8 觀察指標(biāo) 根據(jù)回歸方程，計算前列腺組織中EB的含量及濃度，比較不同處理組前列腺組織中滲出的EB量，以考察經(jīng)腹部前列腺超聲造影處理后血-前列腺屏障通透性的動態(tài)變化情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0軟件，各組計量資料比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物模型建立情況 60只實驗大鼠全部完成實驗，實驗過程中未發(fā)生死亡。大體可見大鼠前列腺表面及其周圍肌層均色澤正常，未見明顯的血腫形成，同時輻照組1例表面及肌層見少許散在出血點，其余未見異常。

2.2 病理表現(xiàn) 對照組大鼠前列腺組織HE染色示組織形態(tài)正常，腺管排列規(guī)整，毛細(xì)血管無充血表現(xiàn)。EB組、同時輻照組及先行輻照組前列腺組織HE染色示組織形態(tài)正常，腺管排列規(guī)整，管腔見少許異形顆粒沉積，毛細(xì)血管稍充血，上皮細(xì)胞排列正常。見圖1。

2.3 EB濃度 對照組及微泡組大鼠前列腺內(nèi)EB濃度極低，EB組大鼠前列腺內(nèi)EB濃度高于對照組及微泡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.157、4.357, P＜0.01）；同時輻照組大鼠前列腺內(nèi)EB濃度高于EB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.438, P＜0.05）。先行輻照組大鼠前列腺內(nèi)EB濃度明顯低于同時輻照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.761, P＜0.05），先行輻照組與EB組EB濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.684, P＞0.05）。見表1。

圖1 A.對照組腺體排列規(guī)整，間質(zhì)無水腫，未見EB染色；B、C. EB組和同時輻照組可見腺腔及間質(zhì)少許EB藍染，部分腺體腫脹變形，間質(zhì)無疏松；D.先行輻照組EB藍染程度較EB組與同時輻照組更為明顯，部分腺體腫脹變形，間質(zhì)無疏松（SABC, ×200）

圖2 各組大體標(biāo)本圖，從左到右依次為對照組、EB組、先行輻照組、同時輻照組。對照組無EB染色腺體呈自然淡紅色，質(zhì)軟、無水腫；EB組、先行輻照組腺體總體呈淡藍色，無明顯顏色深淺差別；同時輻照組腺體EB染色較重

表1 各組前列腺組織EB濃度比較

3 討論

男性生殖系統(tǒng)中的血-睪屏障及血-附睪屏障均具有保護精子抵御外界生理或病理因素襲擾的功能，有利于精子在相對獨立的環(huán)境中發(fā)育[5,6]。在精子通過的腔道中，均有屏障結(jié)構(gòu)存在確保血液中成分有選擇性地進入精道，從而確保精子的安全。前列腺作為男性生殖系統(tǒng)的主要附屬腺體之一，同樣有著促進精子發(fā)育、維持精子活力的重要生理功能。據(jù)此推測，在前列腺內(nèi)也可能存在血-前列腺屏障，以屏蔽血液中對精子有害的成分。部分前列腺炎患者的精子質(zhì)量不同程度地下降，甚至導(dǎo)致不育，提示有血-前列腺屏障的存在。

前列腺炎藥物治療療效欠佳的原因可能是由于存在血-前列腺屏障，導(dǎo)致前列腺內(nèi)部藥物通透性差，許多抗菌藥物不易滲透至前列腺腺管內(nèi)，腔內(nèi)低濃度的藥物難以根除腺體內(nèi)的感染。隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，抗菌藥物在前列腺內(nèi)的濃度大大小于致病菌的最小抑菌濃度，且維持時間短，加大了治療的難度。

為了克服血-前列腺屏障對藥物的抑制，目前通常選用具有高脂溶特性、小分子抗生素等高通過性藥物，或者選擇經(jīng)前列腺內(nèi)注射、經(jīng)直腸微波、藥物栓劑直腸給藥等方法[7]。然而由于前列腺解剖結(jié)構(gòu)特殊，部分治療方法為侵入性操作，不易為患者接受，且治療效果較差[8,9]。因此，如何提高血-前列腺屏障的藥物穿透力，是治療前列腺炎的關(guān)鍵因素之一[10]。超聲微泡造影劑最初用于疾病的診斷，近來研究發(fā)現(xiàn)將微泡造影劑作為攜帶藥物或治療性基因的載體，利用超聲波的照射作用，可以實現(xiàn)藥物的靶向?qū)牒歪尫臶11,12]。

本研究顯示，對照組及微泡組大鼠前列腺內(nèi)EB濃度極低，EB組大鼠前列腺內(nèi)EB濃度明顯高于對照組及微泡組，同時輻照組前列腺內(nèi)藥物濃度高于EB組，且與大體標(biāo)本觀察結(jié)果一致，表明通過給予超聲聯(lián)合微泡造影劑對大鼠前列腺進行靶向輻照，可以增加前列腺組織內(nèi)上皮細(xì)胞的通透性，增加局部藥物的濃度，提高治療效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，先行輻照組大鼠前列腺組織EB濃度明顯低于同時輻照組，與EB組比較無明顯差異。說明微泡造影劑聯(lián)合超聲輻照開放前列腺屏障具有一定的時效性，輻照后30 min內(nèi)前列腺上皮的通透性持續(xù)存在，而后消失，再次給予藥物時無法增加腺體內(nèi)的藥物濃度。即利用超聲微泡可以消除或者減弱血-前列腺屏障對藥物轉(zhuǎn)運的限制，并將藥物選擇性地靶向輸送到病變部位。

總之，微泡造影劑能夠有時效地開放血-前列腺屏障，增加前列腺局部藥物濃度，為微泡造影劑在前列腺疾病中的治療提供了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 唐 潔）

Infuence of Low-dose Ultrasound-mediated Micro-bubble on the Evans Blue Concentration in the Rat Prostate

PurposeTo investigate the influence of low-dose ultrasound (LDUS) mediated microbubble on the increasing Evans blue (EB) concentration in rat prostate.Materials and MethodsSixty male Sprague-Dawley (SD) rats were divided into control group, EB-only group, microbubble-only group, LDUS after EB group and LDUS before EB group. Each group had 12 rats. The control group was injected with 10 ml/kg sodium chloride, EB-only group was given 50 mg/kg EB without LDUS mediation, microbubbleonly group was given with microbubble contrast agent without LDUS mediation, LDUS after EB group was given LDUS mediation right after EB and microbubble injection, the LDUS before EB group was LDUS medicated before EB and microbubble injection. Concentration of EB in prostate tissue was measured homogenated.ResultsEB concentration of rat prostate in EB group was statistically higher than the control group and microbubble-only group (t=4.157 and 4.357, P＜0.01); that in LDUS after EB group was higher than the EB group (t=2.438, P＜0.05); but that in LDUS before EB group was signifcantly lower than LDUS before EB group (t=2.761, P＜0.05); no statistical difference in EB concentration was observed between LDUS after EB group and EB group (t=0.684, P＞0.05).ConclusionLow-dose ultrasound-mediated microbubble can increase in the EB concentration in rat prostate.

Prostate; Ultrasonography; Contrast media; Micro-bubble; Evans blue; Models, animal; Rats

1. 第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院泌尿外科重慶 400037

2. 第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院超聲診斷科重慶 400037

易善紅

Department of Urology, Xinqiao Hospital,

Third Military Medical University, Chongqing 400037, china

Address Correspondence to: YI Shanhong

E-mail: yshh881@aliyun.com

第三軍醫(yī)大學(xué)臨床科研基金項目

（2009XLC22）。

R-33；R445.1

2013-07-19

修回日期：2013-12-24

中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2014年 第22卷 第1期：4-6，11

Chinese Journal of Medical Imaging

2014 Volume 22(1): 4-6, 11

10.3969/j.issn.1005-5185.2014.01.002