肖彥燊，董文銘，王亞海

（湛江中心人民醫(yī)院骨科，廣東湛江524037）

復(fù)方丹參片對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠脛骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的影響

肖彥燊，董文銘，王亞海

（湛江中心人民醫(yī)院骨科，廣東湛江524037）

目的研究復(fù)方丹參片對大鼠類風(fēng)濕相關(guān)骨質(zhì)疏松的對抗作用。方法利用皮下注射牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)SD大鼠發(fā)病，建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠模型，設(shè)立正常對照組、實(shí)驗(yàn)對照組和實(shí)驗(yàn)組（復(fù)方維生素D組及不同劑量的復(fù)方丹參組），分別給予滅菌用水、復(fù)方維生素D及不同劑量的復(fù)方丹參處理2月后，比較各組大鼠脛骨的干重、濕重、長度、周徑以及骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)各組及實(shí)驗(yàn)對照組中大鼠脛骨的濕重、干重及骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)顯著低于正常對照組，而實(shí)驗(yàn)各組大鼠脛骨的上述參數(shù)顯著高于實(shí)驗(yàn)對照組。結(jié)論復(fù)方丹參能部分抵抗類風(fēng)濕疾病引起的骨質(zhì)破壞和骨質(zhì)疏松。

復(fù)方丹參；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；骨質(zhì)疏松；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明的自身免疫性疾病，在我國的患病率高達(dá)0.4%，有近400萬患者［1］。骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是以單位體積內(nèi)骨量減少、骨的微結(jié)構(gòu)退化、骨皮質(zhì)變薄、骨小梁數(shù)目減少、骨髓腔增寬、骨強(qiáng)度減低和易于骨折為特征的系統(tǒng)性骨病。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)RA患者極易發(fā)生骨質(zhì)疏松，而骨質(zhì)疏松極易造成腰椎壓縮性骨折、股骨干骨折及手腕部橈骨骨折，成為RA的重要合并癥，也是其產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥的重要促進(jìn)因素［2］。不僅如此，RA相關(guān)的骨質(zhì)疏松也是其影像學(xué)最早期的改變之一。積極發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的骨質(zhì)疏松具有重要的臨床意義。本研究通過建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，檢測經(jīng)復(fù)方丹參片處理后大鼠脛骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的變化情況，探討復(fù)方丹參片對類風(fēng)濕相關(guān)骨質(zhì)疏松的治療效果，為類風(fēng)濕相關(guān)骨質(zhì)疏松的防治提供新方法。

1 資料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選用4月齡未交配的雄性SD大鼠，SPF級(jí)，平均體重（220±12）g，由中科院上海生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2009－0008。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 復(fù)方丹參片（0.32 g／片，廣州白云山和記黃埔中藥有限公司）；復(fù)方維生素D制劑（廣東醫(yī)學(xué)院科技醫(yī)藥開發(fā)中心提供）；牛Ⅱ型膠原蛋白（20 mg／瓶，Chondrex公司）；弗氏完全佐劑及不完全弗氏佐劑，鈣黃綠素、鹽酸四環(huán)素、Golder′s染料試劑（Sigma公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 參考高曉珺等［3］報(bào)道的方法，即：3%戊巴比妥鈉溶液（1.5 mL·kg－1）腹腔注射將大鼠麻醉后，于每只大鼠尾根部皮下注射0.12 mL膠原乳劑（含膠原240μg）進(jìn)行初次免疫。7 d后，同法于大鼠臀背部兩側(cè)皮下各注射0.03 mL膠原乳劑（共含膠原乳劑120μg）進(jìn)行激發(fā)免疫。炎癥評分≥2分即隨機(jī)入組。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 隨機(jī)抽取10只大鼠歸入正常對照組，將成功建立模型的大鼠60只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組12只。實(shí)驗(yàn)組以灌胃的方式給予復(fù)方丹參，每天1次，每次100μL，劑量依次為2.5、5、10 g·（kg·d）－1，陽性對照組給予復(fù)方維生素D制劑，正常對照組及實(shí)驗(yàn)對照組均給予同體積滅菌蒸餾水，三組的飼養(yǎng)環(huán)境及方式均相同（詳見表1）。處理2月后，采用麻醉法處死大鼠，留取右側(cè)脛骨組織用于分析。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給予藥物劑量

1.2.3 骨標(biāo)本的取材及制備 以3%戊巴比妥鈉（1.5 mL·kg－1）進(jìn)行腹腔注射麻醉，分離脛骨，去除肌肉，用低速鋸切取脛骨上段組織，迅速將其置入10%磷酸鹽緩沖液配制的甲醛溶液中固定24 h，再經(jīng)70%乙醇脫水后，用特殊骨染料染色5 d。從50%乙醇開始逐級(jí)脫水及丙酮脫脂，最后用甲基丙烯酸甲酯包埋不脫鈣骨，采用硬組織切片機(jī)切成9 μm厚片進(jìn)行測量。

1.2.4 大鼠脛骨物理指標(biāo)測定 大鼠麻醉處死后，取左側(cè)脛骨，除凈附著在骨上的肌肉和軟組織，用AE240電子天平稱量濕重（BWW）后于烤箱烘干至恒重，再次稱量即為其干重（BDW）。用帶表的游標(biāo)卡尺測量脛骨內(nèi)側(cè)髁起至內(nèi)踝之間的距離為脛骨長度（BL），脛骨中段的周徑作為脛骨周長（BC）。

1.2.5 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測定 將右側(cè)脛骨上端骨標(biāo)本制成9μm骨切片后，在距離骨垢線1 mm處置遠(yuǎn)端3 mm沿生長板的走向分別畫波浪線或直線，然后測量該范圍內(nèi)的骨組織總面積，骨小梁總面積及骨小梁總周長，計(jì)算骨小梁面積百分?jǐn)?shù)（%Tb.Ar），骨小梁寬度（Tb.Wi），骨小梁數(shù)量（Tb.N），骨小梁分離度（Tb.Sp）。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析及LSD－t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方丹參片對大鼠脛骨物理指標(biāo)的影響 與正常對照組相比，實(shí)驗(yàn)對照組中大鼠脛骨濕重（BWW）和干重（BDW）明顯降低（P＜0.05），而脛骨長度（BL）及脛骨中段周長（BC）無明顯變化（P＞0.05），表明類風(fēng)濕疾病導(dǎo)致了明顯的骨質(zhì)破壞和骨量減少，而對骨的長度和周徑無顯著影響。在低、中及高劑量復(fù)方丹參組和復(fù)方維生素D組，大鼠脛骨的BWW和BDW均顯著高于實(shí)驗(yàn)對照組（P＜0.05），但BL及BC無明顯變化（P＞0.05），表明復(fù)方丹參同復(fù)方維生素D一樣，能改善類風(fēng)濕疾病引起骨質(zhì)破壞和骨質(zhì)疏松，但對骨的長度及骨的周徑并無顯著影響（表2所示）。需要注意的是，高劑量復(fù)方丹參片及維生素D組中大鼠脛骨的BWW和BDW仍然顯著低于正常對照組（P＜0.05），表明二者均未能完全改善類風(fēng)濕疾病導(dǎo)致的骨質(zhì)破壞。

表2 復(fù)方丹參片對大鼠脛骨物理指標(biāo)的影響（±s）

表2 復(fù)方丹參片對大鼠脛骨物理指標(biāo)的影響（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)對照組比較，＃P＜0.05

組別 BWW（mg）BDW（mg） BL（mm） BC（mm）831.2±26 672.2±18 32.3±0.4 4.4±0.3實(shí)驗(yàn)對照組 669.3±31*516.8±20*34.8±0.7 4.6±0.2復(fù)方丹參低劑量組 706.2±19＃567.3±14＃31.7±0.9 4.2±0.5復(fù)方丹參中劑量組 751.5±23＃613.3±18＃29.9±0.7 4.3±0.7復(fù)方丹參高劑量組 811.6±22＃*653.8±16＃*30.5±0.8 4.7±0.4復(fù)方維生素D組 803.2±28＃*642.6±20＃*正常對照組33.6±0.5 4.5±0.6

2.2 復(fù)方丹參片對大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的影響 正常對照組、實(shí)驗(yàn)對照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠脛骨上段骨組織計(jì)量學(xué)中靜態(tài)參數(shù)骨小梁面積百分?jǐn)?shù)（%Tb.Ar）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）的變化情況如表3所示。同正常對照組相比，實(shí)驗(yàn)對照組的%Tb.Ar、Tb.Th及Tb.N顯著降低（P＜0.05），而Tb.Sp顯著增加（P＜0.05），提示類風(fēng)濕病變導(dǎo)致大鼠脛骨上段松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，呈現(xiàn)出典型的骨質(zhì)疏松狀態(tài)。而低、中、高劑量復(fù)方丹參組及復(fù)方維生素D組中，%Tb.Ar、Tb.Th及Tb.N的值較實(shí)驗(yàn)對照組顯著增加（P＜0.05），Tb.Sp值則顯著降低（P＜0.05），提示復(fù)方丹參片及復(fù)方維生素D明顯改善了類風(fēng)濕病變導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松狀態(tài)。另外，高劑量復(fù)方丹參組及復(fù)合維生素D組的上述參數(shù)同正常對照組相比仍然存在顯著差異（P＜0.05），表明二者均未能完全改善類風(fēng)濕疾患引起的骨質(zhì)疏松。

表3 復(fù)方丹參片對大鼠脛骨上段松質(zhì)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的影響（±s）

表3 復(fù)方丹參片對大鼠脛骨上段松質(zhì)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的影響（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)對照組比較，＃P＜0.05

組別 %Tb.Ar Tb.Th（μm）Tb.N（＃／mm）Tb.Sp（μm）28.1±3.3 58.3±9.3 5.1±0.7 208.1±32.2實(shí)驗(yàn)對照組 8.3±1.6*37.6±2.3*1.2±0.27*469.2±57.5*復(fù)方丹參低劑量組 13.6±1.1＃41.3±1.8＃1.7±0.28＃375.3±36.4＃復(fù)方丹參中劑量組 16.7±2.2＃45.1±2.9＃2.7±0.35＃346.4±38.4＃復(fù)方丹參高劑量組 21.3±2.9＃*47.1±2.7＃*3.2±0.45＃*272.3±30.6＃*復(fù)方維生素D組 20.7±2.5＃*50.6±3.5＃*3.4±0.43＃*264.7±29.6＃正常對照組*

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，其發(fā)病率在自身免疫性結(jié)締組織病中列居首位。研究發(fā)現(xiàn)，全身性骨質(zhì)疏松和近關(guān)節(jié)的骨破壞是其最常見的并發(fā)癥之一，在其發(fā)病的2年內(nèi)即可能出現(xiàn)［4］。如不加以干預(yù)，這種骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)破壞會(huì)貫穿于整個(gè)RA病程之中，造成人群勞動(dòng)力喪失和致殘［5］。由于原因不清，目前臨床上尚缺乏有效的治療手段和早期干預(yù)措施。因此，尋找類風(fēng)濕相關(guān)骨質(zhì)疏松的有效治療方法具有非常重要的意義。

作為著名的傳統(tǒng)中藥，丹參具有抗氧化、改善微循環(huán)，防止血栓形成等多種作用［6］，有關(guān)丹參的各種制劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床心血管疾病的治療［7］。但相比之下，有關(guān)丹參的骨藥理作用研究的不多，其在這方面的研究目前也僅限于其對骨折［8］、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松［9］、糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松［10］等方面。為進(jìn)一步增加丹參的應(yīng)用范圍，更為了給類風(fēng)濕相關(guān)骨質(zhì)疏松的治療尋找有效的治療方法，本研究是首次通過類風(fēng)濕相關(guān)骨質(zhì)疏松大鼠模型，就復(fù)方丹參對類風(fēng)濕相關(guān)骨質(zhì)疏松的治療效果進(jìn)行的探討，并對其能夠有效減輕類風(fēng)濕相關(guān)骨質(zhì)疏松的機(jī)制進(jìn)行的初步分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)對照組中大鼠脛骨的濕重、干重均顯著低于正常對照組，表明類風(fēng)濕疾病能顯著引起骨質(zhì)破壞及骨質(zhì)疏松，這與類風(fēng)濕疾病的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果是一致的。然而，復(fù)方丹參各實(shí)驗(yàn)組及復(fù)方維生素D組中大鼠脛骨的干重、濕重介于正常對照組和實(shí)驗(yàn)對照組之間，且與兩組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，表明復(fù)方丹參僅僅能夠在一定程度上減輕類風(fēng)濕病變引起的骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)破壞。丹參的骨藥理學(xué)作用研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參可以通過增加骨組織局部的血液供應(yīng)，影響各種修復(fù)細(xì)胞如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的功能，促進(jìn)骨痂形成進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合［11］。本研究中脛骨上段松質(zhì)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)表明，復(fù)方丹參組中大鼠脛骨的各參數(shù)值均顯著高于實(shí)驗(yàn)對照組，表明該組中骨組織的骨量明顯增加，骨質(zhì)疏松程度明顯緩解，說明丹參能夠有效增加骨量形成，減輕骨質(zhì)疏松。因此，其機(jī)制可能與促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制有關(guān)。

此外，需要注意的是，同正常對照組相比，即使高劑量丹參治療組及復(fù)方維生素D組中的各參數(shù)都是顯著偏低的，表明丹參及復(fù)方維生素D并未完全緩解類風(fēng)濕因素造成的骨質(zhì)破壞。目前，類風(fēng)濕引起骨質(zhì)疏松的原因被認(rèn)為主要有兩個(gè)方面［12］：一是類風(fēng)濕本身激發(fā)自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的直接或間接地骨質(zhì)損壞，主要表現(xiàn)為破骨細(xì)胞的激活和由此導(dǎo)致的骨質(zhì)破壞。二是在類風(fēng)濕治療過程中使用大劑量糖皮質(zhì)激素所引起的骨質(zhì)疏松，主要表現(xiàn)為大量糖皮質(zhì)激素引起成骨細(xì)胞數(shù)量減少、活性降低和生存時(shí)間縮短。本研究在動(dòng)物模型的建立及后續(xù)處理中并未使用糖皮質(zhì)激素，表明復(fù)方丹參片未能完全緩解類風(fēng)濕疾病造成的骨質(zhì)疏松的原因可能與糖皮質(zhì)激素造成骨質(zhì)疏松的機(jī)制無關(guān)，而可能是通過目前尚不清楚的機(jī)制改善了類風(fēng)濕疾病引起的骨質(zhì)疏松。因此，為進(jìn)一步明確丹參的骨藥理作用，有必要進(jìn)行更加深入的研究以探討丹參改善類風(fēng)濕相關(guān)疾病導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松可能機(jī)制。

綜上，復(fù)方丹參片能夠顯著緩解類風(fēng)濕疾病相關(guān)骨質(zhì)疏松，但是這種緩解是不完全的，其機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Fufang Danshen Tablets on static bone histomorphology parameters of cancellous bone tissue in CIA rats

XIAO Yan-shen，DONGWen-ming，WANG Ya-hai
（Central People′s Hospital of Zhanjiang，Zhanjiang 524037，China）

ObjectiveTo study the effect of Fufang Danshen Tablets against osteoporosis of CIA rats.MethodsCIA ratmodel was established by injecting bovine type II collagen subcutaneously.Three groups including normal control group（n＝10），experimental control group（n＝12）and experimental group（n＝12）were built and themice were treated with sterilized water or Fufang Danshen Tablets，respectively for 2 months.Parameters including wet weight，dry weight，length and circumference，aswellas the static bone histomorphology parameters of themice shin bone in each group were collected for analysis.ResultsThe wetweight，dry weight and static bone histomorphology parameters of bone tissue in experimental and experimental control group were significantly lower than that in normal control group，the similar resultswere found between experimental control group and experimental group.ConclusionFufang Danshen Tablets can obviously inhibit bone erosion and osteoporosis in CIA rats，but further study was needed for clarifying themechanism.

Fufang Danshen；Rheumatoid arthritis；Osteoporosis；CIA

R965

：A

2095－5375（2014）07－0379－004

肖彥燊，男，主治醫(yī)師，研究方向：骨質(zhì)疏松的預(yù)防與治療，E－mail：xysh1979＠126.com