劉衍志，陳 艷，高 翔，蘇艷杰，崔 燎

（廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524023）

·實(shí)驗(yàn)研究·

塞來(lái)昔布對(duì)大鼠骨組織的影響

劉衍志，陳 艷，高 翔，蘇艷杰，崔 燎

（廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524023）

目的探討塞來(lái)昔布對(duì)大鼠骨組織的影響。方法16只3月齡雌性SD大鼠隨機(jī)分為兩組：正常對(duì)照組和塞來(lái)昔布給藥組，每組8只。塞來(lái)昔布組大鼠每天灌胃給予塞來(lái)昔布50 mg·kg－1，正常對(duì)照組給予等量生理鹽水。給藥時(shí)間為8周，每周記錄大鼠體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取大鼠左側(cè)股骨用雙能X線骨密度儀（DXA）測(cè)定骨密度，用三點(diǎn)彎曲法測(cè)定股骨生物力學(xué)特性，然后再用離子發(fā)射光譜儀測(cè)定股骨中的Ca、P、Mg的含量。另取大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨做不脫鈣骨磨片測(cè)定骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)。結(jié)果塞來(lái)昔布50 mg·kg－1用藥8周與對(duì)照組相比，明顯降低大鼠股骨骨密度，但是對(duì)皮質(zhì)骨骨量、骨形成率、礦化沉積率、股骨最大載荷和斷裂載荷等均未產(chǎn)生顯著性損害，也并未降低股骨中Ca、P、Mg的含量。結(jié)論塞來(lái)昔布用藥8周明顯降低股骨骨密度，但并未進(jìn)一步損害皮質(zhì)骨骨量、骨形成、骨礦無(wú)機(jī)質(zhì)含量和骨生物力學(xué)特性。

塞來(lái)昔布；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；骨組織；大鼠

目前臨床上已有報(bào)道類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在治療的過(guò)程中，患者的骨骼質(zhì)量會(huì)受到不同程度的損害［1，2］。這種損害主要來(lái)源于兩個(gè)方面，一個(gè)是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎本身，研究報(bào)道患者即使無(wú)藥物的干預(yù)，炎癥本身也會(huì)對(duì)骨骼產(chǎn)生一系列的影響［3，4］，另一個(gè)來(lái)源于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎所使用的藥物。塞來(lái)昔布（Celecoxib，Cel）是一種Cox－2選擇性抑制劑，是臨床常用的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。以往的研究報(bào)道，長(zhǎng)時(shí)間使用塞來(lái)昔布，在控制病情的同時(shí)也會(huì)對(duì)骨骼帶來(lái)一些負(fù)面的影響。然而，塞來(lái)昔布藥物的長(zhǎng)期使用對(duì)骨質(zhì)量的影響并不明了。這是因?yàn)轭愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在治療的過(guò)程中，疾病本身對(duì)骨骼的影響很可能掩蓋藥物對(duì)骨骼的真實(shí)作用，反過(guò)來(lái)也一樣；而且在治療疾病的過(guò)程中，往往是多種藥物的聯(lián)合使用，這可能遮掩了單一藥物對(duì)骨骼的實(shí)際作用。為了更合理地在臨床上使用塞來(lái)昔布，減少其可能對(duì)骨骼產(chǎn)生的副作用，本研究以正常大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，從骨形態(tài)計(jì)量學(xué)、骨密度、骨生物力學(xué)、骨成分等多方面，探討長(zhǎng)期使用塞來(lái)昔布時(shí)，藥物自身對(duì)骨骼的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雌性SD大鼠，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（GUANG DONG）2008－0002。

1.1.2 儀器與試藥 PRODIGY型骨密度儀（美國(guó)GE公司）；MTX 858 Mini Bionix型材料測(cè)試系統(tǒng)（美國(guó)MTSSystem公司）；IRIS／AP型ICP離子性發(fā)射光譜儀（美國(guó)IJA公司）；塞來(lái)昔布膠囊（西樂(lè)葆）（美國(guó)輝瑞制藥公司生產(chǎn)，批號(hào)：J20080059）。

1.2 方法 將16只正常健康的3月齡雌性SD大鼠隨機(jī)分為：正常對(duì)照組（Con）和塞來(lái)昔布給藥組（Cel），每組8只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后，塞來(lái)昔布組每只大鼠用灌胃的方式給予塞來(lái)昔布50 mg·（kg·d）－1，正常對(duì)照組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)計(jì)劃給藥8周，每周記錄大鼠體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠用3%戊巴比妥麻醉，心臟取血處死。動(dòng)物處死前13 d和14 d在大鼠皮下注射四環(huán)素（50 mg· kg－1），另在處死前3 d和4 d在大鼠頸部皮下注射鈣黃綠素（10 mg·kg－1），進(jìn)行大鼠體內(nèi)骨形成雙熒光標(biāo)記。分離右側(cè)脛骨中段制作不脫鈣骨磨片，進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。分離大鼠左側(cè)股骨，用骨密度儀（DXA）進(jìn)行骨密度（BMD）掃描分析，隨后左股骨及另取第六腰椎椎體利用材料測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲力學(xué)和腰椎壓縮生物力學(xué)檢測(cè)。將做完生物力學(xué)的左股骨收集，用6 mol·L－1鹽酸消化，得到濾液，以濾液－雙蒸水＝1∶200比例稀釋，然后用離子性發(fā)射光譜儀測(cè)定Ca、P、Mg等元素的含量，再依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品含量及樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算股骨中Ca、P、Mg等元素的含量。

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

3 結(jié)果

從第3周開(kāi)始給藥后，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)給藥期間，塞來(lái)昔布組大鼠體重與對(duì)照組體重相比，無(wú)顯著性差異，僅在第7周后略有下降，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 塞來(lái)昔布用藥8周對(duì)大鼠體重的影響

與對(duì)照組相比，塞來(lái)昔布組股骨骨密度明顯下降（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 塞來(lái)昔布用藥8周對(duì)大鼠股骨骨密度的影響注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05

塞來(lái)昔布組與對(duì)照組相比，大鼠脛骨中段骨骨髓面積百分?jǐn)?shù)（%Ma.Ar）和皮質(zhì)骨面積百分?jǐn)?shù)（% Ct.Ar）均無(wú)顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 塞來(lái)昔布用藥8周對(duì)大鼠脛骨中段骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)數(shù)據(jù)的影響

塞來(lái)昔布組大鼠脛骨中段骨骨組織計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)參數(shù)熒光周長(zhǎng)百分率、礦化沉積率、骨形成率與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表1。

與對(duì)照組相比，塞來(lái)昔布組及地塞米松組，股骨中Ca、P、Mg含量均無(wú)明顯改變，結(jié)果見(jiàn)圖4。

塞來(lái)昔布組與對(duì)照組相比，彈性載荷和最大載荷無(wú)明顯改變，骨生物力學(xué)參數(shù)無(wú)顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)圖5。

表1 塞來(lái)昔布用藥8周對(duì)大鼠脛骨中段骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)的影響（±s）

表1 塞來(lái)昔布用藥8周對(duì)大鼠脛骨中段骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)的影響（±s）

注：L.Pm代表皮質(zhì)骨外圈骨熒光周長(zhǎng)，%L.Pm代表皮質(zhì)骨外圈骨熒光周長(zhǎng)百分率，MAR代表礦化沉積率，BFR代表骨形成率，E－L.Pm代表皮質(zhì)骨內(nèi)圈骨熒光周長(zhǎng)，E－%L.Pm代表皮質(zhì)骨內(nèi)圈骨熒光周長(zhǎng)百分率

組別 L.Pm（mm） %L.Pm（%） MAR（μm·d－1）BFR［μm·（d·100）－1］E－L.Pm（mm） E－%L.Pm（%）3 0.34±0.12 9.31±3.34 0.29±0.18 7.57±4.52塞來(lái)昔布給藥組 4.38±2.56 51.23±30.65 1.02±0.45 40.48±25.0正常對(duì)照組 3.52±0.87 40.76±9.57 0.89±0.34 38.51±22.32

圖4 塞來(lái)昔布用藥8周對(duì)大鼠股骨骨礦物質(zhì)含量的影響

圖5 塞來(lái)昔布用藥8周對(duì)大鼠股骨三點(diǎn)彎曲力學(xué)參數(shù)的影響

4 討論

本研究結(jié)果表明，塞來(lái)昔布給藥8周對(duì)大鼠的體重沒(méi)有明顯的影響，與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，塞來(lái)昔布組大鼠的胃口和行為均未觀察到異常。但在股骨骨密度的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，大鼠股骨骨密度較正常組明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示，長(zhǎng)期使用塞來(lái)昔布會(huì)對(duì)骨骼產(chǎn)生負(fù)面影響。以往有臨床數(shù)據(jù)顯示，患者長(zhǎng)期使用塞來(lái)昔布可能損傷正常的骨骼功能，導(dǎo)致骨密度下降。臨床觀察與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［5］。我們進(jìn)一步從骨形態(tài)計(jì)量學(xué)方面檢測(cè)了大鼠皮質(zhì)骨的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)骨骨量并未減少，骨形成的相關(guān)指標(biāo)也與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，提示塞來(lái)昔布并未抑制骨形成。這與以往一些文獻(xiàn)報(bào)道一致，雖然本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)報(bào)道用的不是相同的模型［6］。然而，同樣也有報(bào)道顯示，Cox－2選擇性抑制劑在體內(nèi)抑制骨轉(zhuǎn)換導(dǎo)致成骨抑制以及對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能有潛在的干擾［7，8］。Muller等［9］進(jìn)一步報(bào)道只有一小部分NSAIDs抑制作用可見(jiàn)于成骨分化階段，據(jù)推測(cè)，NSAIDs對(duì)骨細(xì)胞或者骨前體細(xì)胞的影響可能是通過(guò)抑制前列腺素的合成介導(dǎo)的，因?yàn)榍傲邢偎?具有刺激骨形成的作用，針對(duì)這個(gè)有爭(zhēng)議的結(jié)果，有報(bào)道給出了更好的解釋，處在炎癥狀態(tài)還是非炎癥狀態(tài)，塞來(lái)昔布對(duì)骨形成產(chǎn)生的結(jié)果可能不同，Yoon等［10］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NSAIDs對(duì)炎癥狀態(tài)和非炎癥狀態(tài)下的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果，在炎癥狀態(tài)下使用高濃度Cox－2抑制劑，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化會(huì)受到抑制，而在非炎癥狀態(tài)下則不會(huì)。

本實(shí)驗(yàn)利用ICP檢測(cè)股骨中的骨礦物質(zhì)Ca、P、Mg的含量試圖解釋骨密度下降，但并未發(fā)現(xiàn)股骨中礦物質(zhì)的顯著減少。提示塞來(lái)昔布的使用使骨密度降低的原因并不在于骨礦無(wú)機(jī)物質(zhì)方面。在本課題組另外進(jìn)行的塞來(lái)昔布使用12周對(duì)正常大鼠骨質(zhì)量的影響實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布組大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶明顯增高，使用骨形態(tài)計(jì)量學(xué)對(duì)大鼠脛骨上段松質(zhì)骨的破骨細(xì)胞分析結(jié)果顯示（數(shù)據(jù)未列出），塞來(lái)昔布組大鼠骨吸收明顯加強(qiáng)，破骨細(xì)胞數(shù)量增多，破骨細(xì)胞周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)明顯增加。這提示塞來(lái)昔布的使用造成骨密度的降低源于破骨細(xì)胞活性的增加，骨吸收加強(qiáng)所導(dǎo)致。那么骨密度的降低對(duì)大鼠骨生物力學(xué)是否會(huì)產(chǎn)生顯著影響？本實(shí)驗(yàn)利用測(cè)完骨密度大鼠的左側(cè)股骨以及新分離的第六腰椎椎體，進(jìn)一步探討大鼠的骨生物力學(xué)參數(shù)性能，與對(duì)照組相比，大鼠股骨彈性載荷，最大載荷和斷裂載荷均未見(jiàn)顯著性降低，但腰椎最大壓縮載荷有下降趨勢(shì)。這說(shuō)明塞來(lái)昔布造成的骨密度降低可能是單純的破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，但是骨吸收增強(qiáng)的幅度尚沒(méi)有實(shí)質(zhì)性改變皮質(zhì)骨的大小和厚度，且在成骨活動(dòng)和骨成分并未發(fā)生明顯退化的情況下，塞來(lái)昔布8周的使用，雖然減少了骨密度，但還不足以造成大鼠骨骼明顯的力學(xué)性能下降。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用骨形態(tài)計(jì)量學(xué)，骨密度，骨生物力學(xué)，骨礦物質(zhì)含量等多方面檢測(cè)表明長(zhǎng)期使用高劑量的塞來(lái)昔布會(huì)引起骨密度的降低，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，但塞來(lái)昔布8周的使用尚不足以引起正常大鼠明顯的骨量、骨礦物質(zhì)含量和骨生物力學(xué)的降低。

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Effects of celecoxib on bone in SD rats

LIU Yan-zhi，CHEN Yan，GAO Xiang，SU Yan-jie，CUILiao
（Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drug，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，China）

ObjectiveTo determine the effects of celecoxib on bone tissue in SD rats.MethodsSixteen 12－weeks－old female SD ratswere randomly allocated into 2 groups with 8 rats in each group：intact control（saline，daily，oral gavage）and celecoxib（50 mg·kg－1，daily，oral gavage）.Ratswere administered by celecoxib for 8 weeks and were weighted weekly.The left femur of the rats was used to scan by DXA forbonemineral density（BMD），determined by three bending test for bonemechanical properties and analyzed by ICP for the content of Ca，P，Mg in the femur.The cortex bone of middle tibiaswere processed for bone histomorphometry analysis.ResultsCelecoxib decreased femur BMD significantly while did not deteriorate cortex bonemass，bone formation and biomechanic properties significantly at a dose of 50 mg·kg－1daily for 8 weeks in rats.ConclusionThe results indicated that celecoxib had impairmenton BMD.Buthad no further deterioration on cortex bonemass，bone formation，bonemineral composition and biomechanic properties.

Celecoxib；RA；Bone tissue；Rat

R965

：A

2095－5375（2014）07－0373－004

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81273518）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2012B060300027）；廣東醫(yī)學(xué)院青年基金（No.XQ1310）

劉衍志，男，研究方向：骨質(zhì)疏松的機(jī)制及防治，E－mail：liuyanzhi02＠163.com

崔燎，女，博士研究生，教授，研究方向：骨質(zhì)疏松的機(jī)制及防治、骨細(xì)胞生物學(xué)及分化調(diào)控、腫瘤藥理學(xué)，Tel：0759－2388305，E－mail：cuiliao＠163.com