韋光輝, 李東, 左其生, 張亞妮, 朱睿, 張蕾, 劉志永, 邱峰龍, 李碧春

揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室, 揚州 225009

Oct4(Octamer-binding transcription factor 4)即八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子, 又稱為 POU5F1, 屬于 POU家族的一個同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子[1～3]。Oct4是第一個被發(fā)現(xiàn)只在多能細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子, 對于調(diào)控胚胎干細(xì)胞的自我更新、維持其未分化狀態(tài)起著關(guān)鍵性作用。因此, Oct4經(jīng)常被用來作為鑒定多能細(xì)胞的標(biāo)記物[4～7]。

研究表明, 轉(zhuǎn)錄因子Oct4的精確表達(dá)對維持胚胎干細(xì)胞多能性具有關(guān)鍵調(diào)控作用, 表達(dá)量過高或過低均會影響胚胎干細(xì)胞的自我更新狀態(tài)[8]。同時,Oct4基因與胚胎干細(xì)胞(ES)分化密切相關(guān)。Niwa等[9,10]研究表明, 通過調(diào)控 ES細(xì)胞中Oct4基因的表達(dá)水平導(dǎo)致ES細(xì)胞向不同方向分化。當(dāng)Oct4正常表達(dá)水平上調(diào)50%時, ES細(xì)胞分化為原始內(nèi)胚層和中胚層, 而當(dāng)Oct4正常表達(dá)水平下調(diào)50%時, ES細(xì)胞會向滋養(yǎng)層方向分化。只有Oct4維持正常表達(dá)水平時, ES細(xì)胞才能夠保持其未分化狀態(tài)和多能性。此外, Oct4還通過與Sox、FoxD3等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,共同調(diào)控下游靶基因的表達(dá), 從而維持胚胎干細(xì)胞的自我更新狀態(tài)。另一方面, 在多能細(xì)胞中, Oct4也能激活一系列有助于維持細(xì)胞多能性的基因表達(dá)[11,12]。

Oct4基因的表達(dá)水平對多能干細(xì)胞的維持和向不同方向分化起著重要作用。啟動子區(qū)域決定基因起始時間、控制基因表達(dá)的程度, 是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控最重要的結(jié)構(gòu)。因此, 研究Oct4基因啟動子對于闡明其基因表達(dá)調(diào)控是必不可少的。de Silva等[13]利用曲古抑菌素誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞,提高了SAMHD1基因的表達(dá)量。Teng等[14]添加丙戊酸后增強了小鼠Oct4基因啟動子的活性。Oct4是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因, 目前關(guān)于羊Oct4基因啟動子的功能研究報道較少。本研究采用雙熒光素酶報告基因載體對徐淮山羊Oct4基因啟動子進(jìn)行分析, 通過瞬時轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞(gEF)、非洲綠猴 SV40轉(zhuǎn)化的腎細(xì)胞(COS7)和P19(小鼠畸胎瘤細(xì)胞)細(xì)胞系, 檢測雙熒光報告基因活性, 確定了徐淮山羊Oct4基因啟動子的核心調(diào)控區(qū)域, 同時探討了TSA和VPA對Oct4基因啟動子活性的調(diào)控作用, 為進(jìn)一步揭示山羊Oct4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

徐淮山羊來自江蘇丹陽珥陵山羊交易市場,PGL3-Basic、pRL-SV40、pEGFP-N1和感受態(tài) DH5α為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 徐淮山羊Oct4基因啟動子克隆

參照GenBank數(shù)據(jù)庫已公布的山羊Oct4基因序列, 采用 Primer5.0設(shè)計一對特異性引物 PGL3-Oct4P1(表 1), 以提取的徐淮山羊血液基因組 DNA為模板進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。擴增條件：95℃ 4 min;98℃ 10 s, 60℃ 18 s, 72℃ 90 s, 共 30個循環(huán); 72℃延伸 6 min。PCR產(chǎn)物末端加A后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, PCR產(chǎn)物連接pMD19-T載體。經(jīng)轉(zhuǎn)化、酶切鑒定后命名為 pMD19-Oct4P1, 由上海英俊生物工程有限公司測序。

1.2.2 Oct4基因啟動子各缺失片段的克隆

參照Oct4基因啟動子區(qū)域以及潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測的結(jié)果, 固定下游引物不變, 變化上游引物, 設(shè)計了6對不同長度片段的啟動子引物(引物序列見表1)。以pMD19-Oct4P1為模板進(jìn)行各片段的擴增, 分別與 pMD19-T載體連接, 構(gòu)建包含Oct4基因啟動子不同片段的克隆載體。構(gòu)建后由上海英俊生物工程有限公司測序。

表1 用于擴增Oct4基因不同缺失片段的引物

1.2.3 雙熒光素酶表達(dá)載體PGL3-Oct4P的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ(Thermo公司)分別對包含Oct4基因不同啟動子片段的克隆載體pMD19-Oct4P(P1～P7)進(jìn)行雙酶切, 同時用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切 PGL3.0-Basic載體, 經(jīng)酶切得到的Oct4不同長度片段分別與雙酶切后的PGL3.0-Basic載體進(jìn)行連接, 構(gòu)建7個包含不同長度的Oct4基因啟動子的熒光素酶表達(dá)載體, 分別命名為PGL3-Oct4P1、PGL3-Oct4P2、PGL3-Oct4P3、PGL3-Oct4P4、PGL3- Oct4P5、PGL3-Oct4P6 和PGL3-Oct4P7。載體構(gòu)建示意圖見圖1。

圖1 含有Oct4啟動子不同長度片段的雙熒光素酶報告載體PGL3-Oct4P構(gòu)建示意圖

1.2.4 pEGFP-N1/1546載體的構(gòu)建

分別用限制性內(nèi)切酶AseⅠ和XhoⅠ對pEGFP-N1和N1/p1546的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切, 酶切產(chǎn)物回收后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化。經(jīng) PCR、酶切、測序鑒定正確后命名為pEGFP-N1/1546。

1.2.5 細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種于24孔板, 細(xì)胞密度為1×105細(xì)胞/孔, 待細(xì)胞匯合度培養(yǎng)至 80%～90%時進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染, 重組質(zhì)粒 PGL3-Oct4P (P1～P7)、pRL-SV40以30:1的比例共轉(zhuǎn)染gEF、P19和COS7細(xì)胞。同時共轉(zhuǎn)染空載體PGL3-Basic和pRL-SV40作為空白對照組; 另外, 用重組質(zhì)粒 pEGFP-N1/1546轉(zhuǎn)染gEF細(xì)胞, 同時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1, 作為陽性對照。具體參照LipofectamineTM2000產(chǎn)品操作步驟說明書。

1.2.6 TSA和VPA對Oct4長片段啟動子活性的誘導(dǎo)

采用終濃度為 1 μmol/L的 TSA和終濃度為 4 mmol/L的 VPA(均購自 SIGMA公司)對轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒 PGL3-Oct4P2的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo), 以無任何添加的重組質(zhì)粒PGL3-Oct4P2轉(zhuǎn)染組為對照組。36 h后進(jìn)行雙熒光素酶報告基因檢測。

1.2.7 Oct4啟動子缺失片段活性分析和GFP的檢測

采用 Dual-Luciferase?Reporter assay System(Promega公司)檢測系統(tǒng)測定報告基因的表達(dá)水平。具體操作參照Promega雙熒光報告檢測試劑盒說明書。分別記錄螢火蟲熒光值和海腎熒光值的 3次讀取結(jié)果。熒光素酶相對活性的數(shù)值為 3次重復(fù)實驗結(jié)果的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。pEGFP-N1/1546載體轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后在熒光顯微鏡下檢測綠色熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 Oct4基因啟動子各片段的克隆

以擴增得到的1966 bp的Oct4基因啟動子片段為模板, 用Oct4基因啟動子不同長度片段的上、下游引物分別進(jìn)行PCR擴增。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：擴增出的條帶為 1966 bp、1546 bp、976 bp、645 bp、465 bp、268 bp 和 126 bp, 與預(yù)期條帶大小一致(圖2)。

圖2 Oct4基因啟動子不同片段擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 雙熒光素酶表達(dá)載體PGL3-Oct4P和pEGFPN1/1546載體的酶切鑒定

包含Oct4啟動子不同片段的重組雙熒光素酶表達(dá)載體 PGL3-Oct4P分別采用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoI進(jìn)行雙酶切驗證。經(jīng)2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 結(jié)果顯示：各泳道均出現(xiàn)兩條帶, 且條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致, 表明所構(gòu)建的載體正確(圖3)。pEGFP-N1載體中的CMV啟動子替換為Oct4基因的啟動子片段 P2, 利用AseⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果出現(xiàn)兩條近似4300 bp和1546 bp的條帶, 分別與去除啟動子 CMV后的pEGFP-N1和P1546片段大小一致(圖4)。

圖3 雙熒光素酶表達(dá)載體PGL3-Oct4P酶切鑒定

圖4 載體pEGFP-N1/1546雙酶切鑒定

2.3 Oct4基因啟動子活性分析

7個重組質(zhì)粒 PGL3-Oct4P(P1～P7)分別與 pRLSV40共轉(zhuǎn)染gEF、P19和COS7細(xì)胞, 同時設(shè)置對照組, 共轉(zhuǎn)染空載體PGL3-Basic和pRL-SV40。

雙熒光報告基因檢測結(jié)果表明,Oct4基因啟動子不同片段在 3種細(xì)胞中表現(xiàn)出不同程度的啟動子活性(圖 5), 并且Oct4啟動子相同片段在不同細(xì)胞中的活性也不同。在3種細(xì)胞中, P2(–1516～+30 bp)啟動子活性最高, P7(–96～+30 bp)活性最低。–238～–96 bp 區(qū)域啟動子活性下降明顯, –96～+30 bp區(qū)域基本無啟動子活性, 表明啟動子基本活性區(qū)域為–238～+30 bp; 在–1516～–946 bp、–615～–96 bp 區(qū)域, 啟動子活性隨片段長度增加而升高, 表明這些區(qū)域存在正調(diào)控元件, 而在–1936～–1516 bp、–946～–615bp區(qū)域啟動子活性隨著片段長度增加而下降, 表明這些區(qū)域存在負(fù)調(diào)控元件。

圖5 Oct4啟動子的活性檢測

2.4 TSA和VPA對Oct4基因啟動子活性的誘導(dǎo)

經(jīng)過對PGL3-Oct4P2質(zhì)粒不同濃度誘導(dǎo)的篩選,終濃度為 1μmol/L的 TSA和終濃度為 4mmol/L的VPA對Oct4基因啟動子活性誘導(dǎo)效率最高。誘導(dǎo)后的雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示：與對照組相比, 在 gEF、P19和 COS7細(xì)胞中, 單獨添加 VPA,Oct4啟動子活性分別相應(yīng)提高了 2.5倍、3倍和 4倍; 單獨添加 TSA,Oct4啟動子活性分別相應(yīng)提高了8.4倍、11.2倍和12倍; 而聯(lián)合添加VPA和TSA,Oct4啟動子活性分別相應(yīng)提高了10.1倍、12.2倍和13.5 倍(圖 6)。

圖6 TSA和VPA對Oct4啟動子活性的誘導(dǎo)

2.5 Oct4長片段啟動子活性的定性分析

雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果證明Oct4基因啟動子具有啟動子活性, 為驗證其長片段是否具有啟動子活性, 選取啟動子Oct4啟動子長片段P2(–1516～+30 bp)片段替換 pEGFP-N1 載體中的CMV啟動子, 替換后轉(zhuǎn)染gEF細(xì)胞。同時轉(zhuǎn)染陽性對照 pEGFP-N1。熒光結(jié)果分析表明, 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1/1546的gEF細(xì)胞有GFP表達(dá), 但弱于陽性對照質(zhì)粒 pEGFP-N1(圖 7), 該結(jié)果進(jìn)一步驗證了Oct4啟動子長片段能夠啟動GFP的轉(zhuǎn)錄, 具有啟動子活性。

圖 7 Oct4基因啟動子長片段啟動子活性的熒光檢測(100×)

3 討 論

啟動子是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平的最基本結(jié)構(gòu), 通過研究啟動子的結(jié)構(gòu)和功能可以更好地了解基因的表達(dá)模式[15,16]。Oct4屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族, 對于維持胚胎干細(xì)胞的自我更新及其全能性具有重要作用, 同時也是參與體外誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的關(guān)鍵基因[17]。本研究針對山羊Oct4基因啟動子的功能進(jìn)行了初步探討, 對于進(jìn)一步揭示Oct4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制具有重要意義。

本文采用目前研究基因調(diào)控的常用方法——5′端逐步缺失突變技術(shù)[18,19], 研究Oct4啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。根據(jù)Oct4啟動子序列, 構(gòu)建了包含7個不同長度啟動子片段的螢光素酶報告基因表達(dá)載體,同時設(shè)置含有海腎熒光報告基因的PGL3-SV40載體作為內(nèi)參, 分別轉(zhuǎn)染gEF、COS7和P19細(xì)胞。雙熒光報告基因檢測結(jié)果表明：在同一種細(xì)胞中, 啟動子活性隨著啟動子片段大小的不同而不同; 而在不同細(xì)胞中, 片段相同的Oct4基因啟動子的活性強度存在差異。在以上轉(zhuǎn)染的 3種細(xì)胞中, 相同大小片段的啟動子在 COS7細(xì)胞中測得活性最高, 其次是P19細(xì)胞, 最后是 gEF細(xì)胞。分析原因可能是不同種屬細(xì)胞間存在的差異。COS7是經(jīng)SV40病毒基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系, 能組成型地表達(dá)SV40 T抗原, 使得任何復(fù)制啟始位置帶有 SV40的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒能夠以很高的拷貝數(shù)進(jìn)行復(fù)制[20], 常用于病毒和轉(zhuǎn)染研究以及對細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的研究中。P19是小鼠畸胎瘤細(xì)胞, 是一種多能性細(xì)胞, 而 Oct4基因在多能細(xì)胞中表達(dá)量豐富, 是鑒定多能細(xì)胞的標(biāo)記物。gEF是山羊胎兒成纖維細(xì)胞, 轉(zhuǎn)染效率低。Oct4基因啟動子活性的整體趨勢在以上 3種細(xì)胞中所檢測結(jié)果是一致的。

為驗證其長片段是否具有啟動子活性, 將pEGFP-N1載體中的CMV啟動子替換為Oct4啟動子的 P2(–1516～+30 bp)長片段, 替換后的重組質(zhì)粒pEGFP-N1/1546轉(zhuǎn)染gEF細(xì)胞。熒光結(jié)果分析表明,轉(zhuǎn)染的gEF細(xì)胞有GFP表達(dá), 但弱于陽性對照質(zhì)粒pEGFP-N1, 該結(jié)果進(jìn)一步驗證了Oct4啟動子長片段能夠啟動GFP的轉(zhuǎn)錄, 具有啟動子活性。

在本研究中, 與 P6(–238～+30 bp)區(qū)域相比較,P7(–96～+30 bp)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性下降十分明顯, 幾乎無轉(zhuǎn)錄活性, 這表明–238～–96 bp之間存在重要的正調(diào)控元件, 同時也說明–238～+30 bp區(qū)域是Oct4基因啟動子的基本活性區(qū)域。生物信息學(xué)分析預(yù)測顯示：羊Oct4基因不含典型的 TATA框, 在–238～+30 bp區(qū)域存在 CCAAT box特征序列以及SP1、ADR1和MZF1等轉(zhuǎn)錄因子。已有研究證實, 一個基因的啟動子區(qū)域中缺少 TATA框, 轉(zhuǎn)錄因子SP1能夠參與該基因的轉(zhuǎn)錄起始[21～25]。由于SP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點序列相對保守, 因此推測 SP1在缺乏 TATA 盒的羊Oct4基因啟動子中可能發(fā)揮了重要的作用, 確保Oct4啟動子的基本轉(zhuǎn)錄活性。

Cotterman等[26]研究證實, 可以通過改變基因富集區(qū)域和已知基因遠(yuǎn)距離區(qū)域的組蛋白乙?；瘉碚{(diào)節(jié)整個基因組的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。本研究為進(jìn)一步驗證Oct4基因的表達(dá)是否存在組蛋白修飾, 采用組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA、VPA來誘導(dǎo)Oct4啟動子活性。本研究參考DETSA最佳誘導(dǎo)濃度以及Teng摸索的VPA最適濃度, 對TSA和VPA最佳濃度進(jìn)行了篩選, 結(jié)果表明終濃度為1 μmmol/L的TSA和4 mmol/L的VPA對Oct4啟動子誘導(dǎo)效率最高。通過對gEF、P19和COS7細(xì)胞的誘導(dǎo)檢測,Oct4啟動子活性均有不同程度的提高, 表明Oct4基因存在組蛋白乙酰化修飾作用。

本研究成功構(gòu)建了包含Oct4基因5′側(cè)翼區(qū)一系列不同片段的重組報告基因載體PGL3-Oct4P。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析了各片段的啟動子活性,確定了Oct4基因啟動子的核心區(qū)域及正負(fù)調(diào)控區(qū)域。研究結(jié)果表明：Oct4基因啟動子活性與啟動子片段大小并沒有呈現(xiàn)絕對正相關(guān), 啟動子活性沒有隨著序列長度的增加而升高, 啟動子活性最高的片段是P2 (–1516～+30 bp), 不是最長序列片段 P1(–1936～+30 bp)。片段 P2的啟動子活性比 P3(–946～+30 bp)高, 從片段 P7(–96～+30 bp)到片段 P4(–615～+30 bp),啟動子活性逐步升高, 表明–1516～–946 bp區(qū)域、–615～–96 bp區(qū)域存在正調(diào)控元件, 但具體是哪些元件起增強作用還需要進(jìn)一步研究。在–1936～–1516 bp、–946～–615 bp區(qū)域存在抑制啟動子活性的元件, 具體是哪些元件同樣也需要進(jìn)一步的研究驗證。

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