施楊，徐筱，李昊陽，徐倩，徐吉臣

北京林業(yè)大學，林木育種國家工程實驗室，北京100083

擴展蛋白(Expansin)是植物細胞壁的重要組成成分，通過打斷細胞壁纖維素與半纖維素的非共價鍵，釋放細胞壁多聚物的機械張力，以增加細胞壁的柔韌性[1,2]。眾多研究表明，擴展蛋白除具有增大細胞的功能外，幾乎參與了植物的整個發(fā)育過程，包括細胞生長[3～11]、種子萌發(fā)[8,12～15]、根毛形成[9,16,17]、根系生長[8,14,18～22]、葉原基形成[8,18,20,23]、葉子生長發(fā)育[20,24～26]、果實成熟[9,27,28]、器官脫離[9]、花粉管生長[9,20,29,30]等，在植物抗逆[31～37]方面也具有不可忽視的作用。

作為植物基因組中一類重要的基因家族，擴展蛋白在已檢測的所有種子植物中都有廣泛的分布，不同物種所含的家族成員在基因數(shù)量、序列組成、基因功能等方面都有很大的不同[38]。水稻(Oryza sativaL.)作為世界上最為重要的經(jīng)濟作物之一，已于2002年完成基因組測序[39]。統(tǒng)計分析顯示，水稻基因組中存在多達58個擴展蛋白基因家族成員，這些基因蛋白在水稻的生長、發(fā)育、生殖、抗逆等重要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)上執(zhí)行重要的作用。本文依據(jù)水稻基因組測序的結果，對水稻擴展蛋白基因家族成員的組成、染色體分布、基因結構、基因表達等生物學信息進行了系統(tǒng)分析，以期為功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

水稻擴展蛋白的基本數(shù)據(jù)來源于 Daniel Cosgrove實驗室建立的網(wǎng)站(http://www.bio.psu.edu/expansins/)，以及水稻基因組最新數(shù)據(jù)版本v3.0(http://rgp.dna.affrc.go.jp/)。

1.2 方法

1.2.1 擴展蛋白家族基因染色體的物理定位

依據(jù)Daniel Cosgrove實驗室建立的網(wǎng)站提供的水稻擴展蛋白基因信息，確定每一個基因的染色體物理位置，使用MapDraw軟件[40]繪制擴展蛋白基因在水稻染色體上的分布圖。

1.2.2 擴展蛋白序列分析

利用生物信息學軟件MEGA v5.0并采用Neighbor-joining算法[41]構建水稻擴展蛋白基因氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹；利用 Protein Homology/analog-Y Recognition EngineV2.0軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)進行蛋白二級和空間結構預測。利用在線軟件 Mobyle 1.5(http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py#welcome)計算水稻擴展蛋白各種氨基酸的個數(shù)及總數(shù)，特定氨基酸的比例為特定氨基酸的數(shù)量占所有氨基酸總數(shù)的百分比。采用生物信息學軟件DNAMAN v7.0對水稻擴展蛋白家族成員進行序列間一致率比對；利用密碼子分析軟件CodonW v1.4.4[42]和EMBOSS(歐洲分子生物學開放軟件系統(tǒng))中的 CHIPS程序對水稻擴展蛋白密碼子偏好性(Codon usage bias)進行統(tǒng)計分析；通過WebLogo 3[43]以及ProtParam[44]在線軟件，對水稻中擴展蛋白的結構保守性、蛋白穩(wěn)定性及相關的理化性質(zhì)進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 基因表達信息分析

將水稻擴展蛋白基因序列與水稻 EST數(shù)據(jù)庫(RAP-DB)[45]進行比對(E-value＜10–6)，獲得擴展蛋白基因在不同組織器官(根、葉、穗)不同發(fā)育階段的表達信息，以文庫中特定基因家族成員的EST數(shù)量所占的比率為信號，繪制基因表達圖譜。

2 結果與分析

2.1 水稻擴展蛋白基因家族及染色體分布

擴展蛋白基因家族分為 A(或 α)、B(或 β)、LA(或γ)和LB(或δ)4個亞家族[24,46,48]。生物信息學分析顯示，水稻基因組中共包含擴展蛋白基因家族成員58個，全部基因的基本信息見表 1。其中A類擴展蛋白34個，約占擴展蛋白基因家族成員總數(shù)的58.6%；B類擴展蛋白19個，約占擴展蛋白基因家族成員總數(shù)的32.8%；LA類擴展蛋白4個，LB類擴展蛋白1個，分別約占擴展蛋白基因家族成員總數(shù)的6.9%和1.7%。利用氨基酸序列建立水稻擴展蛋白家族成員親緣關系圖譜(圖1)，結果表明，亞家族的成員各自聚集成群，顯現(xiàn)出亞家族間規(guī)律性的起源和進化關系。

表1 水稻擴展蛋白基因的基本信息

水稻擴展蛋白基因在染色體上的分布見圖 2。結果顯示：第 3染色體擴展蛋白基因數(shù)目最多，包含 18個家族成員；其他基因分別位于第 1、2、4、5、6、7、8、10和第 12染色體上，分別包含 4、10、5、4、4、2、1、9和 1個家族成員；第 9和第 11染色體上不含有任何擴展蛋白基因?；蚣易宄蓡T在染色體上有成簇存在的現(xiàn)象，同一亞家族的擴展蛋白基因更容易聚集在一起，如第 2染色體上存在由6個A類擴展蛋白基因組成的基因簇；第3染色體上包含一個由8個A類擴展蛋白基因組成的基因簇以及一個由5個B類擴展蛋白基因組成的基因簇；第10染色體上存在一個由5個B類擴展蛋白基因構成的基因簇等。

2.2 水稻擴展蛋白基因的組成結構分析

圖1 水稻基因組中擴展蛋白家族成員的系統(tǒng)進化樹

統(tǒng)計分析顯示，編碼水稻擴展蛋白基因的核苷酸序列長度在 687～1128 bp之間，不同亞家族基因之間序列大小略有差別。其中編碼A類擴展蛋白基因的長度范圍為705～912 bp，平均長度787 bp；編碼B類擴展蛋白基因長度范圍為687～1128 bp，平均長度 847 bp；其他類型擴展蛋白基因長度范圍為771～942 bp，平均長度842 bp。

水稻擴展蛋白基因在基因組中的長度介于705～6464 bp之間，不同擴展蛋白基因包含數(shù)目、大小不等的內(nèi)含子，但不同亞家族的外顯子/內(nèi)含子模式有一定的保守性。其中34個A類擴展蛋白基因亞家族中，17(50%)個基因分別含有 1個內(nèi)含子，14(41%)個基因分別含有2個內(nèi)含子；19個B類擴展蛋白基因亞家族中，9(47%)個基因分別含有 3個內(nèi)含子；而LA和LB類擴展蛋白成員多含有4個內(nèi)含子(表 2)。

擴展蛋白的氨基酸長度介于 228～375aa之間，平均長度269aa。不同亞家族擴展蛋白組成結構類似，均由信號肽、催化區(qū)、吸附區(qū) 3個部分組成[46,49]，其空間結構也清楚顯示出3個相對獨立的結構域(圖3)。N端的信號肽區(qū)大約有 18～30個氨基酸，可形成α螺旋，引導初生的多肽透過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)切除修飾后的肽鏈由高爾基體轉運分泌到細胞壁；位于序列中段的催化區(qū)(Catlysis domain, catdom)大小約15 kDa，其核心序列與內(nèi)切葡聚糖酶EG45(纖維素酶系中的一個主要成分，可在葡聚糖鏈的隨機位點降解底物產(chǎn)生寡糖)有較高的同源性；位于羧基端的與纖維素酶類似的纖維素吸附區(qū)(Cellulose-binding Domain，CBD)大小約10 kDa，長度較為保守，主要由3′端一個外顯子編碼。催化區(qū)、吸附區(qū)的氨基酸組合形成的二級結構多為β折疊和無規(guī)則卷曲。

水稻擴展蛋白不同亞家族的氨基酸組成分析見表3。整個家族氨基酸組成比例介于1.98%～11.89%之間，平均為 4.96%。不同亞家族之間的氨基酸組成比例跨度差異較大，其中A類蛋白的氨基酸組成比例介于1.31%～12.96%之間，平均為4.98%。B類蛋白的氨基酸組成比例介于1.93%～10.85%之間，平均為4.95%。

LA的氨基酸組成比例介于 0.07%～20.23%之間，平均為4.89%。LB的氨基酸組成比例介于1.17%～9.34%之間，平均為4.98%。部分氨基酸在不同亞家族間的比例相近，如纈氨酸(Val)在A、B、LA、LB中的數(shù)值分別為 6.84%、7.46%、8.46%和 7.39%；個別氨基酸在不同亞家族間的比例差異極為顯著，如精氨酸(Arg)在 A、B、LA、LB中的數(shù)值分別為4.19%、10.06%、20.23%和4.28%。

2.3 水稻擴展蛋白基因序列相似性分析

2.3.1 序列一致率比較

DNA序列比較發(fā)現(xiàn)，水稻 58個擴展蛋白基因中，A23和B1分別有2個拷貝(A23a/b，B1a/b)。除個別基因外，水稻擴展蛋白亞家族基因之間序列一致率(或相似率)小于 50%，而同一亞家族不同成員之間一致率大于50%，如A19與A20之間一致率為94.7%，B1(a/b)和B13之間一致率為96.6%，而A19和B1(a/b)之間一致率只有45.8%。氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，除個別基因外，亞家族基因之間一致率小于35%，而同一亞家族不同成員之間的一致率大于35%，如A19與A20之間、B1(a/b)和B13之間一致率均為 96.2%，而 A19和 B1(a/b)之間一致率只有27.6%。相對而言，A與B類、LA與LB類亞家族基因之間分別有較高的氨基酸一致率，而A/B類與LA /LB類亞家族之間的氨基酸一致率較低(表4)。

2.3.2 氨基酸保守性分析

圖2 水稻中擴展蛋白基因的染色體分布

表2 水稻擴展蛋白基因的內(nèi)含子數(shù)目比較

圖3 擴展蛋白A1的空間結構預測

表3 水稻4類擴展蛋白亞家族成員氨基酸組成分析

表 4 水稻擴展蛋白亞家族成員間氨基酸或核苷酸(括號內(nèi)數(shù)字)序列一致率(%)比較

分別對A類和B類擴展蛋白氨基酸的保守性進行了分析(圖4)。結果顯示，擴展蛋白的信號肽部分序列差異較大，而催化區(qū)、結合區(qū)部分相對保守，并且含有幾個豐富且異常保守的氨基酸，如催化區(qū)的半胱氨酸(C)和結合區(qū)的色氨酸(W)等。半胱氨酸被認為與二硫鍵的形成有關[50]，但A類擴展蛋白的保守半胱氨酸殘基有8個，B類只有6個。

2.4 水稻擴展蛋白密碼子使用偏好性分析

對水稻 58個擴展蛋白基因家族成員的 15 635個密碼子進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)氨基酸同義密碼子的相對使用頻率(Relative frequency of synonymous codon,RFSC)(某一密碼子在樣本中的實際觀察數(shù)與該密碼子對應的氨基酸在樣本中的實際觀察數(shù)的比值)具有明顯的偏好性(表5)。如編碼苯丙氨酸(Phe)的2個密碼子UUU和UUC，前者的使用頻率只有8.23%，后者的使用頻率達到91.77%，因此UUC被定義為Phe的高頻密碼子(相對同義密碼子使用頻率單值超過 60%或超過該組同義密碼子平均占有頻率的 1.5倍的密碼子)[51]。所有多密碼子編碼的氨基酸以及終止子均具有高頻密碼子，共計26個，Arg、Leu、Val、Thr、Ala等分別具有 2個高頻密碼子，Ser具有 3個高頻密碼子。

2.5 水稻擴展蛋白理化特征分析

統(tǒng)計分析(表6)表明，水稻擴展蛋白的分子量介于25.40～34.45之間，A類均值達到27.71，B類均值達到 29.51，總平均值為 28.51；家族成員蛋白質(zhì)的理論等電點介于4.69～9.76之間，平均值達到7.85，近 70%的水稻擴展蛋白成員表現(xiàn)偏堿性；擴展蛋白成員的總平均疏水性(Grand average of hydropathicity, GRAVY) 介于–0.36～+0.18 之間，均屬于親疏性相當?shù)膬尚缘鞍?正值表示疏水性，負值表示親水性，介于±0.5之間為兩性蛋白)[52]；擴展蛋白成員的不穩(wěn)定性指數(shù)介于21.6～53.76之間，超過77%的擴展蛋白結構穩(wěn)定性較好(＞40為不穩(wěn)定)；擴展蛋白質(zhì)的脂溶指數(shù)介于59.4～85.74之間，平均值達到70.61，較高的蛋白脂溶指數(shù)使得水稻擴展蛋白可以較好地適應各種環(huán)境。LA3、A10、B12、B17和LB1的脂溶指數(shù)甚至超過80，屬于嗜熱型蛋白[53]。

圖4 水稻A、B類擴展蛋白亞家族成員氨基酸序列保守性分析

表5 水稻擴展蛋白基因密碼子的相對使用頻率(%)

表6 水稻擴展蛋白分子量及理化性質(zhì)

續(xù)表

圖 5 擴展蛋白家族成員在不同水稻組織器官中的表達分析

2.6 水稻擴展蛋白成員的表達模式分析

從水稻不同組織器官的 12個文庫中檢測到了擴展蛋白的表達信息，以文庫中特定家族成員 EST數(shù)量所占的比率作為信號，繪制水稻擴展蛋白基因的時空表達圖譜(圖 5)。結果表明，A、B類亞家族基因表達的分布和豐度更高一些，而LA、LB類亞家族基因只在個別組織器官中表達。其中，水稻根中B亞家族表達量更高，幼嫩葉片和穗子中A亞家族表達更為豐富，但隨著穗子的成熟，B亞家族的表達由弱變強。

3 討 論

擴展蛋白廣泛存在于植物基因組中，是植物細胞壁不可或缺的重要組成部分，也是物種進化過程中的重要鏈條之一。通過對擴展蛋白基因家族的系統(tǒng)生物信息學分析，有助于了解物種、亞家族、基因的基本特征，探索基因的起源和親緣關系，分析基因在物種進化過程中的作用和地位，了解基因的功能。

水稻擴展蛋白基因家族包含4個亞家族，擴展蛋白在內(nèi)含子/外顯子模式、序列一致率、氨基酸組成以及基因表達模式上均呈現(xiàn)一定的亞家族特征，顯示其進化上的規(guī)律，可以作為亞家族分類的重要依據(jù)，如除個別基因外，不同亞家族成員之間氨基酸的一致率低于 35%，而同一亞家族的成員之間大于35%；A類亞家族基因含有1或2個內(nèi)含子(約占91%)，而B類含有3個內(nèi)含子(占47%)，LA和LB類更趨向于4個內(nèi)含子；A類蛋白含有較多苯丙氨酸(Phe)，B類蛋白含有較多賴氨酸(Lys)，LA類蛋白含有較多的精氨酸(Arg)，LB類蛋白含有較多的絲氨酸(Ser)；A類在芽中表達更高，B類在根和成熟穗中表達更高，LA和LB只在某些特定的部位表達。

另外，擴展蛋白也呈現(xiàn)一定的種屬特征，主要表現(xiàn)在A/B類擴展蛋白比例、密碼子偏好性等方面。如在已經(jīng)完成測序的 3種模式植物水稻、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和楊樹(Populus)基因組中，A類擴展蛋白基因占總擴展蛋白基因的比例分別約為59%、72%和 75%，B類擴展蛋白的比例分別約為33%、17%和8%，水稻基因組中具有更多的B類擴展蛋白基因，而楊樹和擬南芥基因組中含有更多的A類擴展蛋白基因，這一現(xiàn)象在玉米(Zea maysL.)、木瓜(Chaenomeles sinensis)等基因組中也有類似的特征，顯現(xiàn)出擴展蛋白家族組成在單雙子葉植物中的區(qū)別。

密碼子的使用偏好性有利于基因的高效率表達[51,54,55]，也是分類學上的一個重要指標。本研究對水稻擴展蛋白密碼子使用頻率分析發(fā)現(xiàn)，所有多密碼子氨基酸及終止子均具有密碼子使用偏好性，這一結果與水稻轉錄因子MADS密碼子的偏好性非常吻合[56]，高頻密碼子的數(shù)量和種類幾近相同。同時，不同物種擴展蛋白的密碼子使用頻率表現(xiàn)不同，如在楊樹、擬南芥以及水稻、玉米中，編碼苯丙氨酸(Phe)的 UUC密碼子的使用頻率分別為 54.7%、55.0%、91.8%和 92.7%；擴展蛋白所有高頻密碼子的分布和數(shù)量也表現(xiàn)迥異，分別有 18、18、8和 5個氨基酸共 26、22、8和 6個高頻密碼子。3種終止密碼子在幾個物種中的使用頻率也不盡相同(表7)，特別是在UAA和UGA的選擇上，水稻更趨向使用 UGA，而楊樹和擬南芥更趨向使用 UAA。物種之間的密碼子偏好性差異，不僅顯示出種屬特征，為基因的異源表達和基因工程育種工作提出了新的思路。

表7 不同物種擴展蛋白終止密碼子的RFSC值

擴展蛋白是水稻基因組中不可或缺的組成部分，在植物生長、發(fā)育、生殖、抗性等許多生命活動中起著重要的作用。對不同擴展蛋白的表達分析(圖5)可以看出，擴展蛋白的組成結構影響著基因的功能：A亞家族擴展蛋白更多作用于植物的生長發(fā)育和抗性，而B類亞家族蛋白則趨向于在生殖系統(tǒng)中起作用。如Yu等[17]發(fā)現(xiàn)A17為水稻根毛伸長所必需的基因；高英[57]認為A3基因在水稻中具有抗旱的作用；Choi等[12]發(fā)現(xiàn)水稻A4基因的正義表達有助于植株胚芽鞘和中胚軸的伸長；Ding等[31]研究發(fā)現(xiàn)，A1、A5、A10、B7基因的表達與水稻白葉枯抗性有關；Russell等[58]發(fā)現(xiàn)B類擴展蛋白基因與水稻花粉發(fā)育有關；Tabuchi等[59]發(fā)現(xiàn)玉米中 B類擴展蛋白與花粉管的生長發(fā)育有關。綜上所述，目前有關水稻擴展蛋白功能的研究還比較淺顯，結構與功能的關聯(lián)的研究還比較少。本研究對水稻擴展蛋白系統(tǒng)的生物學信息分析，將為這一領域的研究提供一個基礎平臺。

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