李宜培，劉 芳，尚俊杰，靳 力，王 黎

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年癡呆最常見的類型［1］，其主要病理學(xué)特征為神經(jīng)細(xì)胞外以β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)沉積為主的老年斑(senile plaque，SP)、以神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)異常磷酸化的tau 蛋白聚集為核心構(gòu)成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)以及皮質(zhì)、海馬選擇性的神經(jīng)元變性和缺失［2］。Aβ 作為老年斑的主要組成成分，被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能障礙的主要原因［3］。近年來的實驗表明，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)作為一種保護(hù)性細(xì)胞因子，在各種腦損害中發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護(hù)作用［4］。為探討EPO 在AD 治療中的潛力，本實驗采用大鼠海馬注射凝聚態(tài)Aβ1-40的方法復(fù)制AD 動物模型［5］，通過腹腔注射重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHu-EPO)，觀察了EPO 對AD 大鼠記憶能力和海馬超微結(jié)構(gòu)的影響，檢測海馬突觸蛋白1(synapsin 1，SYP1)蛋白的表達(dá)，并初步探討了其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性2 月齡Wistar 大鼠55只，清潔級，體質(zhì)量250～300 g，動物批號:SCXK(豫)2005-2001，由河南省實驗動物中心提供。Y 迷宮法篩選后48 只大鼠隨機(jī)分為4 組:正常對照組、生理鹽水組(normal sodium，NS)、模型組、EPO 治療組，每組12 只。動物自由飲食，晝夜交替飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度保持為15 ℃～20 ℃。

1.2 主要試劑和實驗儀器 Aβ1-40(美國Sigma 公司);rHu-EPO(上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司);多聚甲醛(美國BBI 試劑公司);兔抗synapsin1多克隆抗體，兔抗β-actin 多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國Santa Cruz 公司);動物組織總蛋白抽提試劑，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司);顯影定影試劑盒(武漢博士德公司)。Y-迷宮(MG-3 型)(張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠)，腦立體定位儀(ZH-藍(lán)星B)(安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，透射電子顯微鏡(荷蘭FEI TecnaiG)。

2 實驗方法及步驟

2.1 Aβ1-40孵育 1 mg Aβ1-40溶于500 μl PBS 中，稀釋為濃度2 μg/μl，置于37 ℃恒溫箱中連續(xù)孵育12 d，蛋白充分伸展形成聚合態(tài)后4 ℃保存。

2.2 術(shù)前訓(xùn)練 48 只大鼠每天上午固定時間Y 迷宮訓(xùn)練，每天20 次，連續(xù)5 d，每只大鼠都達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)，即連續(xù)9 次在60 s 內(nèi)一次到達(dá)安全區(qū)。電刺激參數(shù):電壓50～70 V，延時5 s［6］。

2.3 大鼠模型的建立 6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300～360 mg/kg)后固定于腦立體定位儀上，參照《大鼠腦立體定位圖譜》［7］進(jìn)行定位。使用微量進(jìn)樣器施行海馬注射，每側(cè)海馬注射5 μl。NS 組按照造模方法海馬注射NS 5 μl，正常對照組大鼠不做處理。EPO 治療組大鼠在正常喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上從造模手術(shù)當(dāng)天開始腹腔注射5000 IU/kg rHu-EPO，隔天一次，共5 次。

2.4 Y 迷宮行為學(xué)測試 手術(shù)后第10 天各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)測試。按照術(shù)前訓(xùn)練中的學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)，記錄各組中每只大鼠錯誤次數(shù)、嘗試次數(shù)和全天總反應(yīng)時間。

2.5 海馬電鏡標(biāo)本的制作及觀察 造模手術(shù)后第10 天，Y 迷宮測試完畢后，每組隨機(jī)抽取2 只用于透射電子顯微鏡取材。大鼠麻醉、灌注后切取海馬CA1區(qū)組織塊約1 mm3。包埋后，荷蘭FEI TECNAIG 透射式電鏡下觀察并照像。

2.6 Western blot 蛋白印跡實驗 造模手術(shù)后第10 天，Y 迷宮測試后，每組中隨機(jī)選取6 只大鼠，麻醉后斷頭，取出腦組織，冰上剝離海馬，稱重。應(yīng)用Western blot 檢測SYP1 蛋白的表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 空間記憶能力的改變 與NS 組相比，模型組大鼠錯誤次數(shù)、嘗試次數(shù)和全天總反應(yīng)時間增加而EPO 組大鼠空間記憶能力提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。EPO 治療組大鼠錯誤次數(shù)、嘗試次數(shù)和全天總反應(yīng)時間均減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

3.2 EPO 對大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的影響 正常對照組和NS 組:電鏡下可見海馬神經(jīng)突觸前后膜均一，厚度適中;突觸前膜內(nèi)的突觸小泡清晰可見，突觸間隙清晰;線粒體大小及形態(tài)正常，線粒體膜、嵴完整，內(nèi)嵴清晰可見，基質(zhì)均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)散在分布，表面游離核蛋白體較多。模型組大鼠電鏡下神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)破壞，結(jié)構(gòu)紊亂。突觸密度降低，且均勻不一，突觸間隙變小不清，突觸小泡數(shù)量減少;游離核蛋白體減少，線粒體膜不完整，線粒體嵴模糊。EPO 治療組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，突觸前膜內(nèi)突觸小泡較清晰，突觸間隙清晰;線粒體膜基本完整，線粒體嵴清晰可見。

3.3 Western blot 蛋白印跡實驗 各組海馬組織中均可見SYPl 蛋白表達(dá)。與模型組相比，EPO 組SYPl 蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ﹤0.05)。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(n=12)

4 討論

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是刺激紅細(xì)胞合成的細(xì)胞因子，是組織氧合狀態(tài)的一種主要決定因素，目前臨床上多用于貧血的治療。許多研究表明EPO 作為一種近年來發(fā)現(xiàn)的新型神經(jīng)元保護(hù)因子可以提高腎性貧血患者的認(rèn)知能力［8］，可以明顯抑制缺血缺氧性腦損傷中神經(jīng)元的凋亡［9］，也可以通過抑制Aβ25-35引起cleaved caspase-3 表達(dá)增高而對其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用［10，11］。本實驗采用大鼠海馬注射凝聚態(tài)Aβ1-40的方法，成功建立公認(rèn)的急性Alzheimer 樣大鼠模型，觀察了EPO 對AD 大鼠記憶能力和海馬超微結(jié)構(gòu)的影響，檢測SYP1 蛋白的表達(dá)。

線粒體是存在于真核生物細(xì)胞質(zhì)中、含有核外遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器，是細(xì)胞能力的化工廠。已有研究表明，AD 的發(fā)生與線粒體的結(jié)構(gòu)和功能障礙密切相關(guān)［12～15］。突觸是神經(jīng)元之間一種特化的細(xì)胞連接，是神經(jīng)元信號傳遞的重要結(jié)構(gòu)，通過它的傳遞作用實現(xiàn)細(xì)胞之間的通訊。大量實驗表明，學(xué)習(xí)記憶與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸的結(jié)構(gòu)和功能的可塑性密切相關(guān)。突觸結(jié)構(gòu)的破壞會中斷腦內(nèi)很多功能通路中的聯(lián)系，引起多方面的功能障礙，尤其嚴(yán)重的是認(rèn)知和記憶障礙。本實驗中EPO 提高AD 大鼠空間記憶能力，減輕大鼠海馬線粒體和突觸的破壞，減輕AD大鼠的海馬超微結(jié)構(gòu)損傷程度，減輕其功能的喪失，進(jìn)而改善AD 大鼠的認(rèn)知功能障礙。

SYPl 是一種神經(jīng)元特異的磷蛋白，該蛋白的表達(dá)在海馬結(jié)構(gòu)形成及功能可塑中發(fā)揮一定作用，在突觸發(fā)生、突觸囊泡運(yùn)輸及神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中也有重要的調(diào)節(jié)作用［16，17］。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬組織中由于Aβ1-40對神經(jīng)元的毒性作用，間接抑制了SYP1 蛋白的表達(dá)，而EPO 治療組大鼠與模型組相比SYP1 蛋白表達(dá)明顯增加，說明EPO 能夠拮抗Aβ1-40對神經(jīng)元毒性作用，增加SYPl 蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致遞質(zhì)釋放增加和突觸傳遞能力提高，這可能是EPO 改善AD 大鼠空間記憶能力的另一個機(jī)制。另外，與NS 組相比，EPO 治療組大鼠SYPl 蛋白表達(dá)增加，這提示EPO 對正常大鼠可能也有促進(jìn)SYPl 蛋白表達(dá)的作用。

綜上所述，EPO 可以改善大鼠由Aβ1-40引起的學(xué)習(xí)記憶障礙，提高空間記憶能力，這可能與減輕大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)破壞、減輕其功能的喪失、增加SYPl 蛋白表達(dá)發(fā)生有關(guān)，其深層機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。

［1］Lim GP，Yang F，Chu T，et al.Ibuprofen suppresses plaque pathology and inflammation in a mouse model for Alzheimer’s disease［J］.Neurosei，2000，20(15):5709-5714.

［2］王德生，張守信.老年性癡呆［M］.人民衛(wèi)生出版社，2001.60-77.

［3］Lim YY，Ellis KA，Harrington K，et al.Cognitive consequences of high Aβ amyloid in mild cognitive impairment and healthy older adults:implications for early detection of Alzheimer’s disease［J］.Neuropsychology，2013，27(3):322-332.

［4］邵長榮，姜 紅.促紅細(xì)胞生成素對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠水通道蛋白4 表達(dá)的影響［J］.實用兒科臨床雜志，2012，27(14):1075-1077.

［5］Arif M，Kato T.Increased expression of PAD2 after repeated intracerebroventricular infusions of soluble Abeta(25-35)in the Alzheimer’s disease model rat brain:effect of memantine［J］.Cell Mol Biol Lett，2009，14(4):703-714.

［6］Huang JN，Wang CY，Wang XL，et al.Tenuigentin treatment improves behavioral Y-maze learning by enhancing synaptic plasticity in mice［J］.Behav Brain Res，2013，246(1):111-115.

［7］Paxionos G，Watson C.諸葛啟釧譯.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005.25.

［8］Juul S.Erythropoietin in the central nervous system，and its use to prevent hypoxic-ischemic brain damage［J］.Acta Paediatr Suppl，2002，91(438):36-42.

［9］Juul S.Erythropoietin in the central nervous system，and its use to prevent hypoxic-ischemic brain damage［J］.Acta Paediatr Suppl，2002，91(438):36-42.

［10］Ma R，Xiong N，Huang C，et al.Erythropoietin protects PC12 cells from beta-amyloid(25-35)induced apoptosis viaPI3K/Akt signaling pathway［J］.Neuropharmacology，2009，56(6):1027-1034.

［11］孫治坤，楊紅旗，陸國強(qiáng)，等.促紅細(xì)胞生成素對β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版，2007，27(10):1177-1180.

［12］Schaffer S，Asseburg H，Kuntz S，et al.Effects of polyphenols on brain ageing and Alzheimer’s disease:focus on mitochondria［J］.Mol Neurobiol，2012，46(1):161-178.

［13］Cavauucci V，F(xiàn)erraina C，D’Amelio M.Key role of mitochondria in Alzheimer’s disease synaptic dysfunction［J］.Curr Pharm Des，2013，19(36):6440-6450.

［14］Manczak M，Sheiko T，Craigen WJ，et al.Reduced VDAC1 protects against Alzheimer’s disease，mitochondria，and synaptic deficiencies［J］.Alzheimers Disease，2013，37(4):670-690.

［16］劉 芬，閆 榮.Aβ1-40對PC12 細(xì)胞突觸素表達(dá)的影響［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2010，27(9):49-52.

［17］桂 韋，余傳勇，汪 凱，等.轉(zhuǎn)化生長因子β-1 對神經(jīng)元樹突生長以及突觸素1 表達(dá)的影響［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011，28(10):25-28.