石紅婷，周伯榮，王 融，鄧燕華，關(guān)海濤，劉子凡

氯吡格雷［1］作為一種常見(jiàn)的抗血小板聚集藥，臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明長(zhǎng)期使用氯吡格雷能有效地減少嚴(yán)重不良心腦血管事件(major adverse cardiovascular and cerebrovascular events，MACCE)，然而，因?yàn)閭€(gè)體差異，有部分患者雖然長(zhǎng)期規(guī)律服用氯吡格雷，但仍會(huì)出現(xiàn)心腦血管事件，這種現(xiàn)象稱為氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)［2］。CR 發(fā)生率約16.8%～21%不等，在TIA 及卒中人群中可達(dá)到44%。我們近期研究結(jié)果［3］顯示，腦梗死患者CR 發(fā)生率為30.6%，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的CR 發(fā)生率(腦梗死人群)為28%～44%接近［3］。

腦梗死患者CR 發(fā)生率較高［4，5］。過(guò)去大部分的研究都集中在患者的CR 率。2013 年，我們的研究組首次報(bào)道的CR 動(dòng)態(tài)特性的存在［4］。在本文中，我們分析了P2Y12 和CYP2C19 等位基因的臨床學(xué)特征，并觀察在腦梗死患者中P2Y12 與CYP2C19 基因突變與DCR 發(fā)生的相關(guān)性。我們希望指導(dǎo)臨床早期發(fā)現(xiàn)或預(yù)測(cè)個(gè)體將出現(xiàn)血小板抵抗現(xiàn)象。

1 材料和方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 采用前瞻性、開(kāi)放性、單盲研究，對(duì)入組的腦梗死患者按標(biāo)準(zhǔn)給予氯吡格雷(75 mg/d)，且繼續(xù)服用常規(guī)藥物，如降壓、降脂、降糖等，分別測(cè)定服藥前、服藥2 w、3 個(gè)月及6 個(gè)月后的PAR。根據(jù)服藥2 w 后的PAR，分為CR 組與NCR組，出現(xiàn)CR 的患者將換用或聯(lián)用其他抗血小板藥物(如阿司匹林、西洛他唑等)，并檢測(cè)其2 w 后的PAR 的變化，NCR 患者維持氯吡格雷(75 mg/d)治療，測(cè)定3 個(gè)月、6 個(gè)月后PAR，分為動(dòng)態(tài)抵抗(DCR)組與持續(xù)非抵抗(CNCR)組。同時(shí)本研究按是否攜帶P2Y12εC，分為T(mén)T 組和C 組;按是否攜帶CYP2C19εA，分為GG 組和A 組;按共存基因，分為共存C 與A 組、共存T 與A 組、共存C 與G 組及共存T 與G 組。根據(jù)AHA/ASA(2011 年)發(fā)表的腦卒中二級(jí)預(yù)防指南，所有患者采用電話等方式囑患者繼續(xù)服藥。并要求患者按時(shí)到門(mén)診就診，測(cè)定相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1.2 研究對(duì)象 連續(xù)性選取2011 年9 月～2012 年12 月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的首次或再次新發(fā)的急性腦梗死患者147例，腦梗死組納入標(biāo)準(zhǔn):診斷符合世界衛(wèi)生組織制定的標(biāo)準(zhǔn)［6］，經(jīng)頭部計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)或3.0T 磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)證實(shí)。詳細(xì)的分組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)已發(fā)表的文獻(xiàn)［4］。本研究經(jīng)過(guò)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或其家人均簽署知情同意書(shū)。

1.3 血小板聚集率測(cè)定 按儀器相關(guān)要求［4］，使用的透光率集合度測(cè)定(light transmission aggregometry，LTA，CHRO-N02L0G Corporation，USA)血小板聚集功能。相關(guān)研究證實(shí)這種方法評(píng)估血小板聚集功能是臨床和研究中最常用的方法之一，并作為金標(biāo)準(zhǔn)［7］。CR 的判斷標(biāo)準(zhǔn)［8］，使用ADP 作為激動(dòng)劑的血小板聚集抑制率，即氯吡格雷給藥后14 d血小板聚集比基線下降幅度≤10%稱為氯吡格雷抵抗(血小板聚集抑制率=治療前血小板聚集率-治療后血小板聚集率)，反之為氯吡格雷敏感。

1.4 危險(xiǎn)因素評(píng)估 入院后記錄患者的性別、年齡、血壓，仔細(xì)詢問(wèn)患者既往史、個(gè)人史、服藥史、家族史等。所有患者入院后當(dāng)日行頭部CT 或MRI檢查，次日行血常規(guī)、凝血常規(guī)、生化常規(guī)、血脂常規(guī)、糖化血紅蛋白及血糖等檢查。

1.5 基因分析 分析患者P2Y12 與CYP2C19基因。采取德國(guó)QIAGEN 公司制備的基因組DNA試劑盒從全血中提取DNA。引物由寶生物(大連)有限公司合成。詳細(xì)分析基因的過(guò)程及基因圖片見(jiàn)已發(fā)表的文獻(xiàn)［4］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，用配對(duì)比較資料的秩和檢驗(yàn)(Mannwhitney test)，計(jì)數(shù)資料用t 檢驗(yàn)，對(duì)影響基因的臨床特征學(xué)多因素采用Logistic 回歸分析?；蛐秃偷任换蝾l率采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，應(yīng)用擬合優(yōu)度檢驗(yàn)計(jì)算基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡(H-W 平衡);各組間基因型及等位基因頻率比較四格表χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料的比較 符合上述標(biāo)準(zhǔn)腦梗死患者共147 例，其中26 例(17.7%)因經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、外地定居及支架植入術(shù)需使用雙抗治療等退出本研究，包括6 例CR 患者及20 例NCR 患者，因此本實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)觀察121 例腦梗死患者。觀察結(jié)束，各組被完成的病例數(shù)分別為CR 組(36 例)、NCR 組(85 例)、DCR 組(15 例)、CNCR 組(70 例)。按等位基因分組分析，P2Y12 基因中TT 組與C 組比較及CYP2C19 基因中GG 組和A 組比較在性別、年齡、吸煙等入院時(shí)一般臨床特征上差異無(wú)顯著性(P＞0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因的臨床學(xué)特征分 析 LDL-C(OR=3.581，95% CI 2.070～6.195，P=0.000)為P2Y12εC 的臨床學(xué)因素(見(jiàn)表2);而甘油三脂(OR=2.812，95% CI 1.498～5.281，P=0.001)及糖化血紅蛋白(OR=2.327，95%CI 1.231～4.398，P=0.009)為CYP2Y19εA 的臨床學(xué)因素(見(jiàn)表3)。

2.3 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因或共存基因各組不同時(shí)間段血小板集率的比較 在P2Y12 組，C 組患者服用氯吡格雷前、服用2 w 后、3 個(gè)月后及6 個(gè)月后的PAR 與TT 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而CYP2Y19 組，A 組患者在這4 個(gè)時(shí)間段與GG 組比較，A 組患者PAR 都較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表4)。共存C 與A 組患者服用氯吡格雷前、服用2 w 后的PAR 高于共存T 與A、共存C 與G 及共存T 與G 者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而3 個(gè)月后及6 個(gè)月后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表4)。

2.4 CR、NCR、DCR、CNCR 各組患者基因型和等位基因頻率的分布和分析 CR 及DCR 患者攜帶P2Y12 等位基因C 或T 與NCR 及CNCR 患者攜帶等位基因C 或T 頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CR 及DCR 患者與NCR 及CNCR 患 者CYP2Y19εA 頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示CYP2Y19εA 者CR 發(fā)生率高。CR 與DCR 患者比較，CYP2Y19εA 頻率比較無(wú)明顯差異(P＞0.05，見(jiàn)表5)。CR 及DCR 患者共存等位基因C 與A 頻率高于NCR 及CNCR 患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而共存T 與A、共存C 與G 及共存T 與G 頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表5)。CR 與DCR 患者相比，共存等位基因C 與A 頻率無(wú)明顯差異(P＞0.05，見(jiàn)表5)。

表1 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因分組患者一般資料的比較

表2 P2Y12 等位基因C 的臨床特征學(xué)分析

表3 CYP2Y19 等位基因A 的臨床特征學(xué)分析

表4 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因或共存基因各組不同時(shí)間段血小板集率的比較

表5 CR、NCR、DCR、CNCR 各組患者基因型和等位基因頻率的分析

3 討論

CR 受多方面因素影響，主要有基因多態(tài)性、個(gè)體差異、藥物的相互作用等［4，6，9，10］。其中基因多態(tài)性與CR 的關(guān)系成為當(dāng)今預(yù)防治療的研究熱點(diǎn)，尤其P2Y12、CYP2C19 的基因多態(tài)性。最近相關(guān)研究顯示［11］P2Y12 及CYP2C19 受體的生理作用較為廣泛，影響著血栓形成的多個(gè)病理機(jī)制過(guò)程，如血小板聚集、血脂代謝等。其他相關(guān)研究顯示［12］，在腦梗死的二級(jí)預(yù)防中，抗血小板藥物的貢獻(xiàn)率僅次于降血壓的治療。

我們的研究顯示P2Y12εC 患者服用氯吡格雷前、服用2 w 后、3 m 及6 m 后的PAR 與P2Y12εT 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。據(jù)報(bào)道［13］P2Y12 基因的突變會(huì)降低氯吡格雷的反應(yīng)，但并非所有研究已確認(rèn)P2Y12 基因與CR 之間的關(guān)系［14］。本研究也發(fā)現(xiàn)，CR 及DCR 患者P2Y12εC 的頻率與NCR 及CNCR患者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且多態(tài)性基因型分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單因素分析提示既往有DM、高LDL-C 及GHB 患者P2Y12 變異率較高，但多因素分析，僅LDL-C 為P2Y12εC 的臨床學(xué)特征。從以上研究分析，P2Y12 基因多態(tài)性可能與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，同時(shí)，可能由于存在其他的ADP受體參與氯吡格雷生理作用機(jī)制，因此，P2Y12 基因多態(tài)性與CR 之間的關(guān)系不顯著。

然而有趣的是CYP2Y19εA 患者在4 個(gè)時(shí)間段與CYP2Y19εG 患者比較，CYP2Y19εA 患者PAR 都較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明CYP2Y19εA 與PAR有關(guān)，原因可能為此基因?yàn)榇x酶，其基因突變不僅會(huì)影響氯吡格雷的活性成分在體內(nèi)的形成，還有可能降低降脂類、降壓類等多種藥物的代謝作用，從而增加血小板聚集，導(dǎo)致CR。CYP2C19 基因多態(tài)性已證實(shí)是CR 的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素［8］。最近［15］也發(fā)現(xiàn)CYP2Y19εA 患者降低了抗血小板聚集的作用，且MACCE 發(fā)生率也明顯高于未攜帶者。同時(shí)相關(guān)研究顯示［16］攜帶有缺陷性CYP2C19 等位基因的患者表現(xiàn)出較低的氯吡格雷反應(yīng)，證實(shí)CYP2C19 的突變與CR 有關(guān)。同樣，我們研究也顯示CYP2Y19 基因，CR 及DCR 患者比NCR 及CNCR 患者CYP2Y19εA頻率高，也就是說(shuō)，CYP2Y19εA 者發(fā)生CR 或DCR風(fēng)險(xiǎn)較高。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)既往有DM、LDL-C、血糖濃度及GHB 患者CYP2Y19 變異率高，這些與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［13］，而多因素分析顯示LDL-C 及GHB 為CYP2Y19εA 的臨床特征學(xué)因素，從而提示CYP2Y19εA 并具有高TG 及GHB 者，易發(fā)生CR 或DCR。

考慮單基因多態(tài)性對(duì)血小板功能的影響相對(duì)較弱。從而，共存兩種基因變異可能更易發(fā)生CR。近來(lái)研究［14］已證實(shí)共存CYP2C19εA 與P2Y12εC 的患者與CR 相關(guān)。本研究首次評(píng)估共存基因多態(tài)性對(duì)腦梗死患者CR 和DCR 的影響，結(jié)果顯示，共存CYP2C19εA 與P2Y12εC 者服用氯吡格雷前、服用2 w后的PAR 高于其它共存等位基因型，同時(shí)CR和DCR 患者共存等位基因C 與A 頻率分別高于NCR 和CNCR 患者，相關(guān)研究結(jié)果提示我們共存CYP2C19εA 與P2Y12εC 者易出現(xiàn)CR，這與既往的研究一致［14］。雖然這4 組之間比較，3 m 后及6 m后的PAR 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這種現(xiàn)象表明，相比DCR、CYP2C19εA 與CR 的更密切。另外，在本研究還顯示，DCR 與CR 比較，P2Y12εC、CYP2C19εA 的頻率以及共存C 與A 無(wú)明顯差異，而與NCR 或CNCR 比較，共存C 與A 者明顯增高，提示遺傳基因的因素在DCR 與CR 發(fā)生中的作用機(jī)制類似，且對(duì)DCR 的發(fā)生無(wú)特異性貢獻(xiàn)。本研究在隊(duì)列觀察研究曾報(bào)道，腦梗死患者CR 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素為糖尿病、TIA、高血壓病藥物使用、高膽固醇血癥等，而DCR 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素為高膽固醇血癥［4］，而脂質(zhì)代謝紊亂和長(zhǎng)期高血糖恰好是突變基因的臨床學(xué)特征。這些結(jié)果將為今后如何預(yù)防CR 和DCR 探索了新的思路，尤其對(duì)于DCR 的預(yù)防將可能更應(yīng)該注重血糖和血脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)治療。

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