董銀華，王洪新，陳澤峰，魏 佳，趙 嵐，李 強，范宏光

糖調(diào)節(jié)受損(impaired glucose regulation，IGR)是糖尿病前期糖調(diào)節(jié)失衡的一種表現(xiàn)，一般包括空腹血糖受損(impaired fasting glucose，IFG)和糖耐量受損(impaired glucose tolerance，IGT)。糖尿病是一個較早就被證實與認(rèn)知功能障礙相關(guān)的因素［1］，然而糖耐量受損作為糖尿病前期的一個重要臨床階段，是否與認(rèn)知功能障礙相關(guān)，至今尚無定論［2］。本研究通過建立糖調(diào)節(jié)受損大鼠模型，從炎癥機制角度探討糖調(diào)節(jié)受損與認(rèn)知障礙的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 動物模型制備 SPF 級雄性Wistar 大鼠50 只，體重180～200 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK-(軍)2007-004，隨機分為對照組(NGT 組)和實驗組(IGR組)，每組25 只。兩組均適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w(不計入實驗周期)，NGT 組給予普通飼料;IGR 組給予高脂高糖飼料，自由進(jìn)水，室溫18 ℃～22 ℃，飼養(yǎng)20 w。從第8 周開始，每2 w 取鼠尾靜脈血進(jìn)行一次葡萄糖耐量實驗，空腹血糖6.2～7.5 mmol/L 或者餐后2 h 血糖7.9～10.4 mmol/L 的大鼠造模成功［3］。

1.2 行為學(xué)檢測 NGT 組和IGT 組分別于第5 周、第10 周、第15 周、第20 周，采用Morris 水迷宮試驗測定包括:適應(yīng)性訓(xùn)練、定位航行實驗、空間探索試驗測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，評定認(rèn)知功能。

1.3 腦組織NF-κBp65、TNF-α 免疫組織化學(xué)檢測 造模成功后，每組每個時間點隨機取5 只大鼠深度麻醉后，4%多聚甲醛灌注后，斷頭取腦，以視交叉前緣作后作冠狀位切片，行4 μm 厚的連續(xù)切片，然后依次脫水、透明、浸蠟和包埋。石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，分別滴加第一抗體NF-κB、TNF-α，并4 ℃過夜。滴加生物素標(biāo)記體，37 ℃孵育30 min。滴加過氧化物-鏈霉素卵白素37 ℃孵育30 min。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。目鏡測微尺在200 倍視野下計數(shù)細(xì)胞，分別取大鼠腦組織連續(xù)切片10 片，每片選10 個陽性視野，計數(shù)網(wǎng)格中陽性細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3 次，取其平均值。

1.4 腦組織NF-κB mRNA、TNF-α mRNA 原位雜交檢測 原位雜交寡核苷酸探針試劑盒購自武漢博士德公司，用生物素標(biāo)記。切片透明脫水后用0.01 mmol/L PBS 沖洗，0.2 mmol/L 鹽酸室溫酸化10 min，再次0.01 mmol/L PBS 沖洗后以25 μg/ml 蛋白酶K73 ℃消化10 min，并以2.5 g/L 乙酸酐平衡后，浸入90%(體積分?jǐn)?shù))乙醇脫水。切片在空氣中干燥后，用2 μg/ml 的生物素標(biāo)記寡核苷酸探針孵育組織(30 μl/切片)，42 ℃孵育過夜(對照:雜交反應(yīng)液中不加探針，用有意義鏈作探針)。雜交后系列SSC 洗滌封閉，置0.3%(體積分?jǐn)?shù)H2O230 min)，而后4 ℃抗生物素血清過夜，置試劑盒ABC 液室溫孵育2 h，DBA 室溫染色5 min，陽性反應(yīng)呈棕褐色。

2 結(jié)果

2.1 糖耐量損害大鼠成模情況 高脂高糖飼料飼養(yǎng)10 w 大鼠成模率60%;飼養(yǎng)15 w 大鼠成模率100%，模型組死亡2 只，及時補充。

2.2 認(rèn)知功能評定情況 第5 周IGR 組較NGT 組逃避潛伏期短，空間探索時間長，隨著飼養(yǎng)周期的延長，糖調(diào)節(jié)損害大鼠逐漸成模;第15 周IGR 組大鼠全部成模，IGR 大鼠較NGT 組大鼠逃避潛伏期延長，空間探索穿臺次數(shù)減少，實驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);20 w 時IGR 組與NGT 組大鼠比較學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降(P＜0.01)(見表1)。NGT 組內(nèi)不同時間點比較無差別，IGR 組自10 w 以后逐漸下降，差別顯著(P＜0.01)。隨著飼養(yǎng)周期的延長，達(dá)到糖調(diào)節(jié)受損狀態(tài)，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低。

2.3 大鼠腦 組織NF-κBp65、TNF-α 及NFκBp65mRNA、TNF-αmRNA 表達(dá) NF-κBp65、TNF-α陽性表達(dá)為胞漿呈現(xiàn)棕黃色，強陽性時細(xì)胞核也出現(xiàn)棕黃色顆粒，胞核藍(lán)染。采用平均灰度值比較大鼠腦組織NF-κBp65 和TNF-α 蛋白及mRNA 陽性表達(dá)水平。在第5 周IGR 組與NGT 組兩因子表達(dá)無差異(P＞0.05);與NGT 組比較第10 周IGR 組NFκBp65 及mRNA 表達(dá)有差異(P＜0.05);第15 周、第20 周逐漸增高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與NGT組比較第15 周IGR 組TNF-α 及TNF-α mRNA 表達(dá)有差異(P＜0.05);第20 周有顯著差異(P＜0.01)，具體結(jié)果(見表2～表5)。

2.4 NF-κBp65 及TNF-α 的表達(dá)水平與認(rèn)知之間的關(guān)系 Pearson 直線相關(guān)回歸分析發(fā)現(xiàn)，IGR組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績與NF-κBp65 陽性表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.472，P＜0.05)，與TNF-α 陽性表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.475，P＜0.05)，而NGT 組兩者無明顯相關(guān)性(r=0.260，P＞0.05)。

表1 兩組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力(±s)

表1 兩組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力(±s)

與NGT 組比較* P＜0.05，#P＜0.01;與NGT 組內(nèi)比較▽P＞0.05;IGR 組10 w 以后比較△P＜0.01

表2 兩組大鼠不同時間點腦組織NF-κB 平均灰度值比較(±s)

表2 兩組大鼠不同時間點腦組織NF-κB 平均灰度值比較(±s)

與NGT 組比較* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

表3 兩組大鼠不同時間點腦組織TNF-α 平均灰度值比較(±s)

表3 兩組大鼠不同時間點腦組織TNF-α 平均灰度值比較(±s)

與NGT 組比較* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

表4 兩組大鼠不同時點腦組織NF-κB p65 mRNA 平均灰度值比較(±s)

表4 兩組大鼠不同時點腦組織NF-κB p65 mRNA 平均灰度值比較(±s)

與NGT 組比較* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

表5 兩組大鼠不同時間點腦組織TNF-α mRNA 平均灰度值比較(±s)

表5 兩組大鼠不同時間點腦組織TNF-α mRNA 平均灰度值比較(±s)

與NGT 組比較* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

3 討論

糖調(diào)節(jié)受損(IGR)是糖尿病前期狀態(tài)，是糖尿病的高危人群。糖尿病是癡呆的高危因素已被公認(rèn)。英國前瞻性糖尿病研究發(fā)現(xiàn)，新診斷的2 型糖尿病半數(shù)已有血管病變，提示血管病變可發(fā)生于糖尿病之前，即在IGR 階段已經(jīng)有炎性反應(yīng)的發(fā)生，且可能與血管性認(rèn)知障礙有關(guān)［4］。有研究報道［5］在60 歲以上老年患者人群中正常范圍高血糖水平海馬與杏仁核萎縮明顯，認(rèn)知功能減低明顯。這也提示在診斷糖尿病之前高血糖水平已經(jīng)對腦組織造成損害，影響老年人的認(rèn)知功能。近年研究發(fā)現(xiàn)較多的炎性因子在胰島素抵抗和IGR 的發(fā)生中具有重要作用，如C 反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子-α 等都與糖耐量損害有關(guān)［6］。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，在靜息狀態(tài)下以二聚體狀態(tài)在細(xì)胞漿內(nèi)與IκB 結(jié)合，激活后與IκB 解離，NFκB 核因子定位序列暴露，NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，以二聚體的形式起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，從而誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1、細(xì)胞間粘附分子、腫瘤壞死因子(TNF-α)等的表達(dá)，白細(xì)胞在各種炎性介質(zhì)的介導(dǎo)下，向血管內(nèi)皮細(xì)胞移動、粘附并滲出，參與炎癥的的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致缺血性神經(jīng)元的損傷，另外各項因子如腫瘤壞死因子、白介素的表達(dá)反過來進(jìn)一步增加NF-κB從而進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)［7～9］。

本研究發(fā)現(xiàn)造模成功，第15 周后認(rèn)知功能評價，糖調(diào)節(jié)受損大鼠學(xué)習(xí)記憶、能力明顯遲滯于對照組大鼠，而且隨著時間的延長這種趨勢愈加明顯;同時研究發(fā)現(xiàn)糖調(diào)節(jié)受損大鼠腦組織第10 周開始NFκBp65 蛋白表達(dá)NF-κBp65 mRNA 的表達(dá)均高于正常對照組，TNF-α 蛋白表達(dá)和TNF-α mRNA 的表達(dá)第15 周開始表達(dá)明顯增高，兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而炎癥因子表達(dá)不同步的原因可能與上游NFκBp65 炎性激活的過程有關(guān)。Pearson 直線相關(guān)回歸分析糖調(diào)節(jié)受損大鼠認(rèn)知功能與NF-κB、TNF-α 的陽性表達(dá)水平呈正相關(guān)。

因此本研究認(rèn)為炎癥機制在認(rèn)知障礙的發(fā)病過程中起著重要的作用，大鼠腦組織NF-κB 和TNF-α炎性因子，參與了大鼠認(rèn)知功能障礙形成的過程。

綜上，糖耐量受損大鼠腦組織炎性因子NF-κB、TNF-α 的表達(dá)明顯高于對照組，且與大鼠認(rèn)知功能障礙明顯相關(guān)，本研究從炎癥角度探討了糖調(diào)節(jié)受損對大鼠認(rèn)知功能障礙的影響，認(rèn)為炎癥機制是糖調(diào)節(jié)受損認(rèn)知功能障礙的重要機制，抗炎治療可能是防治糖調(diào)節(jié)受損認(rèn)知功能障礙的重要靶點。

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