韓冰冰，盧 巖，趙海軍，王 媛

免疫炎癥反應(yīng)促進了腦缺血后的繼發(fā)性腦損害，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的免疫效應(yīng)細胞-小膠質(zhì)細胞的活化則是腦缺血免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵始動因素。有研究報道，針刺可以抑制腦缺血后的炎癥反應(yīng)，調(diào)控炎性介質(zhì)釋放［1］。那么針刺對于腦缺血發(fā)揮抗炎作用是否與小膠質(zhì)細胞的活化有關(guān)?本研究建立MCAO 大鼠模型，從小膠質(zhì)細胞活化的調(diào)控的角度探討針刺抗炎發(fā)揮腦保護作用的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF 級Wistar 大鼠40 只，雄性，體重(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物質(zhì)量許可證編號:SCXK(京)2012-0001。

1.2 實驗儀器 全自動酶標(biāo)儀，RT-2100C 型，深圳雷杜Rayto 公司;激光共聚焦顯微鏡，LSM510型，德國Zeiss;Image pro plus 4.5 圖像處理系統(tǒng)，美國Media Cybernetics 公司。

1.3 實驗試劑 小鼠IBA1 抗體，購自Abcam;FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 及免疫染色固定液、封閉液、洗滌液、稀釋液、封片液均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;EDTA 抗原修復(fù)液，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;TNF-α、IL-1、IL-6 ELISA 試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 模型復(fù)制及分組 采用大腦中動脈栓塞法制成局灶性腦缺血模型［2］。大鼠蘇醒后進行神經(jīng)功能缺損評分，1～3 分為造模成功，隨機配伍分為模型對照組、內(nèi)關(guān)組、曲池組、地機組，每組樣本量均為8。另取8只動物頸總動脈插線僅1 cm 為假手術(shù)對照組。

1.5 針刺方法 曲池穴直刺進針4 mm，內(nèi)關(guān)穴直刺進針1 mm，地機穴直刺進針4 mm。疏密波2/15 Hz，輸出電流1 mA。自造模后第2 天開始，每日于固定時間針刺一次×30 min，連續(xù)5 d。

1.6 Zea Longa 神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準 見相關(guān)文獻［3］。

1.7 動物處死及取材 各組動物分別在針刺5 d 結(jié)束后2 h，處死取腦，大腦沿冠狀面剖為兩半，取前半部分置于液氮凍存，后半部分多聚甲醛固定，石蠟切片。

1.8 HE 染色檢測腦海馬神經(jīng)元壞死率 光學(xué)顯微鏡(400×)觀察大鼠缺血側(cè)海馬的CA3區(qū)，以細胞出現(xiàn)濃染、核固縮、核碎裂為陽性細胞，每張切片選取5 個不同的視野，計算每個視野內(nèi)的陽性細胞占全部神經(jīng)元的百分率，取平均值。

1.9 酶聯(lián)免疫法檢測腦組織炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量 取缺血側(cè)腦組織制備腦組織勻漿，按照試劑盒說明操作。

1.10 IBA1 免疫熒光染色檢測小膠質(zhì)細胞活化 常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，洗滌5 min×3次。EDTA 抗原修復(fù)95 ℃水浴10～15 min，固定10 min，去固定液，洗滌5 min×3 次，吸盡液體。封閉60 min，去封閉，加一抗(1∶200)，濕盒4 ℃孵育過夜。去除一抗，洗滌5 min×3 次。加二抗(1∶500)，室溫避光60 min，洗滌5 min×3 次。封片液中加入DAPI 混勻，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光。每組選5 張切片，高倍鏡(400×)下每張切片隨機取5 個視野，采用IPP 圖像分析軟件測定IBA1 陽性表達的平均光密度(OD)值，取均值作為該切片IBA1 的表達水平。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 針刺對大鼠神經(jīng)體征評分、腦海馬神經(jīng)元壞死率的影響 與假手術(shù)對照組相比，各組大鼠神經(jīng)體征評分、腦海馬神經(jīng)元壞死率均明顯升高(P＜0.01);與模型對照組相比，內(nèi)關(guān)組、曲池組、地機組大鼠神經(jīng)體征評分明顯降低(P＜0.05);與模型對照組相比，內(nèi)關(guān)組、曲池組腦海馬神經(jīng)元壞死率明顯降低(P＜0.05);與地機組相比，曲池組腦海馬神經(jīng)元壞死率明顯降低(P＜0.05)(見圖1)。

2.2 針刺對MCAO 大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響 與假手術(shù)對照組相比，模型對照組TNF-α、IL-1β、IL-6 含量明顯升高(P＜0.01);與模型對照組相比，曲池組TNF-α、IL-6 含量明顯降低(P＜0.05);內(nèi)關(guān)組、曲池組IL-1 含量明顯降低(P＜0.05)(見圖2)。

2.3 針刺對MCAO 大鼠腦組織小膠質(zhì)細胞活化的影響 假手術(shù)對照組IBA1 表達低弱，小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)靜息狀態(tài)，為分支狀;而模型對照組小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)活化狀態(tài)，表現(xiàn)為胞體肥大，突起縮短，分支變少，IBA1 表達增強。與假手術(shù)對照組相比，各組IBA1 表達明顯升高(P＜0.01);與模型對照組相比，內(nèi)關(guān)組、曲池組IBA1 表達明顯降低(P＜0.01);與地機組相比，內(nèi)關(guān)組、曲池組IBA1 表達明顯降低(P＜0.01)(見圖3)。

圖針刺對MCAO 大鼠神經(jīng)體征評分、腦海馬神經(jīng)元壞死率的影響

圖2 針刺對MCAO 大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響

3 討論

目前許多研究均支持免疫性炎癥反應(yīng)參與了缺血性卒中后的腦損傷。腦缺血后數(shù)小時，受損腦區(qū)域的炎癥反應(yīng)開始啟動，持續(xù)數(shù)天，使腦缺血所致的遲發(fā)性腦損傷加重、神經(jīng)細胞的生物學(xué)功能預(yù)后更差，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的免疫效應(yīng)細胞-小膠質(zhì)細胞，則是免疫性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵始動因素［4］。

生理情況下小膠質(zhì)細胞占腦細胞總數(shù)的5%～10%，為腦中數(shù)量居第3 位的重要的免疫細胞。小膠質(zhì)細胞最顯著的特點之一是對外界環(huán)境刺激非常敏感，是第一個針對損傷產(chǎn)生的應(yīng)答細胞，可在局灶性腦缺血48～72 h 內(nèi)出現(xiàn)增殖高峰并可持續(xù)存在數(shù)周。小膠質(zhì)細胞構(gòu)成腦內(nèi)的固有免疫系統(tǒng)，被激活后從分枝狀變成阿米巴狀，突起縮短、胞體肥大，形態(tài)類似巨噬細胞。激活的小膠質(zhì)細胞可以過吞噬清除病原體和細胞碎片以及分泌抗炎物質(zhì)、神經(jīng)生長因子等，有利于神經(jīng)元再生和死亡周邊區(qū)神經(jīng)元的存活，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用［5］。然而，當(dāng)免疫介質(zhì)失控而無限擴大時，小膠質(zhì)細胞則通過釋放和分泌一系列潛在的神經(jīng)毒性物質(zhì)、炎性因子和酶導(dǎo)致繼發(fā)性腦損害［6］。因此，如何抑制小膠質(zhì)細胞的過度活化，將炎癥反應(yīng)控制在適當(dāng)水平，將為腦缺血的治療提供新的途徑。IBA1 是能與小膠質(zhì)細胞發(fā)生特異性結(jié)合的鈣結(jié)合蛋白，當(dāng)小膠質(zhì)細胞激活后，IBA1 的表達量上調(diào)，因此IBA1 通常作為鑒定小膠質(zhì)細胞的標(biāo)記物使用［7］。

圖3 針刺對MCAO 大鼠腦組織IBA1 表達的影響(免疫熒光×400)

本研究結(jié)果顯示，針刺內(nèi)關(guān)、曲池均能顯著降低MCAO 大鼠的神經(jīng)體征評分、腦海馬神經(jīng)元死亡率，并且能明顯抑制腦缺血后IBA1 的異常表達，抑制小膠質(zhì)細胞的活化，降低腦缺血后腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的異常升高。這提示針刺抗炎發(fā)揮腦保護作用的機制與對小膠質(zhì)細胞活化的調(diào)控密切相關(guān)，本研究為進一步探討針刺調(diào)控小膠質(zhì)細胞活化的分子機制提供了依據(jù)和基礎(chǔ)。

［1］秦文熠，羅 勇，余 超.電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬內(nèi)白介素-1β 及轉(zhuǎn)錄核因子κB 抑制蛋白激酶的影響［J］.針刺研究，2013，38(04):271-276.

［2］Yan Lu，Bingbing Han，Shijun Wang.Effects of electroacupuncture on microcirculatory blood flow and glucose transporter function in the hippocampus［J］.Neural Regen Res，2011，6(3):200-205.

［3］王 媛，趙海軍，盧 巖，等.針刺對MCAO 大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)及腦微循環(huán)血流量的影響［J］.江蘇中醫(yī)藥，2013，45(7):70-72.

［4］Weinstein J，Koerner I，Mller T.Microglia in ischemic brain injury［J］.Future Neurol，2010，5(2):227-246.

［5］Hendryk S，Czuba Z，Jedrzejewska-Szypulka H，et al.Increase in activity of neutrophils and proinflammatory mediators in rats following acute and prolonged focal cerebral ischemia and reperfusion［J］.Acta Neurochir Suppl，2010，106:29-35.

［6］Lin HY，Tang CH，Chen JH，et al.Peptidoglycan induces interleukin-6 expression through the TLR2 receptor，JNK，c-Jun，and AP-1 pathways in microglia［J］.Cell Physiol，2011，226(6):1573-1582.

［7］Chatterjee D，Biswas K，Nag S，et al.Microglia play a major role in direct viral-induced demyelination［J］.Clin Dev Immunol，2013，13:1-12.