肖 君，張 函，王 偉，謝敏杰，喻志源，何 丹

急性缺血性卒中是嚴(yán)重危害人類身心健康和生活質(zhì)量的主要疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率、低治愈率的特點(diǎn)［1］。因此，闡明缺血性卒中的復(fù)雜病理生理過程一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多的細(xì)胞，神經(jīng)損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，可能與神經(jīng)損傷后神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)量的增高有關(guān)［2］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族(neurotrophic factors，NTFs)的一員［2，3］，可通過調(diào)控神經(jīng)元的存活和生長、影響突觸可塑性［4］等途徑，在腦卒中的康復(fù)過程中對神經(jīng)元的存活、生長及功能維持起重要的作用［5］。本實(shí)驗(yàn)通過建立體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型、檢測缺氧/復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞活力變化、并觀察缺氧/復(fù)氧對星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF合成及釋放的影響，從而明確腦缺血與星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌功能之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:新生SD 乳鼠，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號:SCXK(鄂)2008-0005。主要試劑:DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Hyclone 公司)，DAPI 及多聚賴氨酸(美國sigma 公司)，多克隆GFAP 抗體(美國Neomarkers 公司)，BDNF ELISA 試劑盒(美國Promega 公司)，兔抗BDNF 多克隆抗體及羊抗兔HRP 二抗(英國Abcam 公司)，GADPH 兔抗單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology 公司)。

1.2 方法

1.2.1 新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 無菌條件下取新生(3 d 內(nèi))SD 大鼠大腦，DMEM/F12 漂洗3 次，剔除軟腦膜，取大腦皮質(zhì)，眼科剪剪碎，巴氏管吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，經(jīng)直徑200 目篩網(wǎng)過濾，800 rpm 離心8 min，棄上清，全培養(yǎng)基(DMEM/F12+20%胎牛血清)重懸，接種于多聚賴氨酸(0.1 mg/ml)包被的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);2～3 d 換一次液。細(xì)胞生長至融合時(shí)按1∶2～3 傳代至新培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為傳2 代細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及缺氧/復(fù)氧模型的建立 本實(shí)驗(yàn)分為兩組:正常組(N)及缺氧/復(fù)氧組(H/R)。采用缺氧孵箱法，將含5%CO2的正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)達(dá)80%融合的星形膠質(zhì)細(xì)胞置于94% N2、1%O2及5% CO2的缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)環(huán)境中，缺氧不同時(shí)間點(diǎn)(3 h、6 h、12 h、24 h)，再置于含5%CO2的正常培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)復(fù)氧時(shí)間(0 h、12 h、24 h、48 h、72 h)，建立星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型。

1.2.3 缺氧/復(fù)氧對細(xì)胞活力的影響 通過MTT 法檢測缺氧/復(fù)氧對細(xì)胞活力的影響，具體方法如下:將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度至10×103/ml，接種至96 孔培養(yǎng)板，每孔160 μl;全培養(yǎng)基(DMEM/F12 培養(yǎng)液+20%胎牛血清)培養(yǎng)18 h～24 h，待細(xì)胞貼壁生長良好后開始MTT 檢測;實(shí)驗(yàn)分3 組:N 組、H/R 組及空白調(diào)零組，每組10 孔，其中不接種細(xì)胞的作為空白調(diào)零組。分別在復(fù)氧后不同時(shí)間點(diǎn)，每孔加入40 μl MTT 液，37 ℃、95% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h;吸走M(jìn)TT 液，每孔加入150 μl DMSO 顯色;輕微震蕩后以空白調(diào)零組調(diào)零，酶標(biāo)儀(460 nm 波長)測定各孔的吸光度值(OD 值)。

1.2.4 ELISA 檢測BDNF 的分泌及合成 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液離心10 min，取上清后，向孔板中加入RIPA 裂解液，冰上裂解15 min 后，離心取細(xì)胞裂解液，均置于-80 ℃冰箱保存。根據(jù)試劑盒的檢測方法分別測量不同時(shí)間點(diǎn)上清及細(xì)胞裂解液中所含的BDNF。

1.2.5 Western blot 檢測BNDF 的合成 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后按3×105/ml 的密度接種至10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿;全培養(yǎng)基(DMEM/F12 培養(yǎng)液+20%胎牛血清)培養(yǎng)12～18 h，待細(xì)胞貼壁生長良好后開始實(shí)驗(yàn);復(fù)氧后不同時(shí)間點(diǎn)提蛋白。BCA 法進(jìn)行蛋白定量。將等量的蛋白標(biāo)本加入SDS-PAGE 凝膠的加樣孔，電泳90 min;然后電轉(zhuǎn)至NC 膜;封閉液封閉2 h 后，加入兔抗BDNF 多克隆抗體(濃度)，4 ℃孵育過夜;TBST 漂洗3 遍后，加入1∶5000 的羊抗兔HRP 二抗，孵育2 h;用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃膜，Quantity One 4.62 進(jìn)行定量分析，并以GADPH 為內(nèi)參進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 缺氧/復(fù)氧對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響 通過倒置顯微鏡，在缺氧不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，隨著缺氧時(shí)間的延長，星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體逐漸皺縮，培養(yǎng)皿內(nèi)的漂浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片逐漸增多。缺氧6 h 以內(nèi)，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)與對照組無明顯差異;而缺氧12 h 后，視野中見星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞破碎甚至死亡。為了排除細(xì)胞死亡對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，選擇缺氧6 h 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)時(shí)間。接著我們用MTT 法檢測缺氧/復(fù)氧對星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。缺氧6 h 后復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)的MTT OD 值與正常組相比無顯著性差異(P＞0.05)，說明單純?nèi)毖鯊?fù)氧72 h 以內(nèi)不會對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯影響(見表1)。

2.2 缺氧/復(fù)氧對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF釋放的影響 我們檢測了缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF 的分泌。結(jié)果表明，與正常對照組相比，缺氧/復(fù)氧組星形膠質(zhì)細(xì)胞條件性培養(yǎng)液中的BDNF 含量雖然有所增加，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，提示單純?nèi)毖?復(fù)氧情況下還不足以引起體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF 分泌的顯著變化。

2.3 缺氧/復(fù)氧對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF 合成的影響 缺氧6 h 復(fù)氧0 h、12 h、24 h 時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞裂解液中的BDNF 的含量較之正常培養(yǎng)組無明顯增高(P＞0.05)，而在復(fù)氧48 h、72 h時(shí)，其BDNF 的含量分別是正常組的1.34 倍和1.46倍，均有顯著增高(P＜0.01)。因此我們運(yùn)用Western blot 檢測了缺氧/復(fù)氧48 h 及72 h 的BDNF 的蛋白含量，在復(fù)氧48 h、72 h 時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF 蛋白的合成有顯著增加(P＜0.01)，與ELISA 檢測結(jié)果一致。

表1 缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞MTT OD 值的影響(±s，n=10)

表1 缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞MTT OD 值的影響(±s，n=10)

3 討論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞是含量最為豐富的膠質(zhì)細(xì)胞類型，對維持大腦功能的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用［6］。經(jīng)過數(shù)年的研究，已經(jīng)證實(shí)了星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅對神經(jīng)元起支持作用，而且還通過合成多種神經(jīng)營養(yǎng)因子對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)的攝取、離子穩(wěn)態(tài)及血腦屏障的維持等起到了支持和保護(hù)的作用［7］。BDNF 為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，調(diào)控神經(jīng)元的存活和生長，影響突觸可塑性，能夠減少神經(jīng)損傷的發(fā)生。因此在本實(shí)驗(yàn)中，通過研究星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧損傷時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的變化以及對BDNF 合成和釋放的影響，對腦缺血后神經(jīng)功能保護(hù)的機(jī)制探討具有重要的意義。

既往研究表明，多種病理情況下，如腦缺血缺氧、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、帕金森氏病以及阿爾茨海默病等，BDNF 對神經(jīng)元的存活起保護(hù)作用［2，8，9］。由此我們推測，腦缺氧時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF 表達(dá)量增加，BDNF 通過調(diào)控神經(jīng)元的存活和生長，從而減少神經(jīng)損傷的發(fā)生。

為了驗(yàn)證上述假說，我們研究了缺氧/復(fù)氧條件下體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力變化及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)釋放和表達(dá)的變化。我們首先運(yùn)用MTT 法檢測了缺氧/復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的變化，發(fā)現(xiàn)單純?nèi)毖? h/復(fù)氧72 h 以內(nèi)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力并無明顯變化，提示本實(shí)驗(yàn)條件下的缺氧/復(fù)氧不會引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡。在此基礎(chǔ)上，我們分別通過ELISA 和Western blot 檢測了缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF的合成和釋放量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BDNF 的釋放量無明顯差異，但是其合成量在復(fù)氧48 h 之后較對照組增加。既往研究對此報(bào)道不一。Qu［10］等人研究報(bào)道，在短暫前額葉缺血時(shí)，BDNF 及其受體水平均上調(diào)，筆者認(rèn)為這是一個(gè)自我保護(hù)的自適應(yīng)機(jī)制，對損傷細(xì)胞的存活生長有重要意義。而另有研究又發(fā)現(xiàn)包括BDNF 在內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子在缺血腦組織(糖氧剝奪1 h、再灌注24 h 后)中的表達(dá)量是下調(diào)的［11］。結(jié)果不盡相同，原因是由于實(shí)驗(yàn)條件、缺氧模型的差異、缺氧及再灌注的時(shí)間以及樣本采集時(shí)間的不同所導(dǎo)致。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示，單純?nèi)毖?復(fù)氧不足以引起體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞BNDF 的釋放改變以及細(xì)胞的活力變化，但是可影響B(tài)DNF 合成的增加，提示BDNF 在腦缺血缺氧情況下可能間接發(fā)揮了一定的腦保護(hù)作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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