馮毅馬亞飛張林波王曉峰魏麗娟

葛根素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注心肌脂質(zhì)過(guò)氧化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

馮毅①馬亞飛①?gòu)埩植á偻鯐苑澧傥蝴惥辎?/p>

目的：觀察葛根素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注（I/R）大鼠心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）與細(xì)胞凋亡的影響。方法：采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只大鼠分為假手術(shù)組（SH組），缺血再灌注組（I/R組），葛根素預(yù)處理組（PU組）三組，每組8只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束測(cè)定心肌丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量以及GRP78 mRNA、CRT mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與SH組比較，其余兩組GRP78 mRNA與CRT mRNA表達(dá)、心肌MDA含量均明顯增加，而心肌SOD水平明顯降低（P＜0.05）。與I/R組比較，PU組GRP78 mRNA與CRT mRNA表達(dá)、心肌MDA含量均降低，且心肌SOD水平明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論：葛根素預(yù)處理可能通過(guò)減輕心肌脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，抑制I/R導(dǎo)致的過(guò)度ERS而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

葛根素； 缺血再灌注； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 脂質(zhì)過(guò)氧化

心肌缺血再灌注（I/R）過(guò)程中由于鈣超載、脂質(zhì)過(guò)氧化、缺氧等多種因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），適當(dāng)?shù)腅RS可誘導(dǎo)多種保護(hù)蛋白表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)缺血再灌注損失的耐受能力，但持續(xù)而嚴(yán)重的ERS則誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和組織損傷[1-2]。研究表明葛根素（puerarin，Pue）可以通過(guò)多種途徑減輕I/R導(dǎo)致的心肌損傷[3-4]。因此，本研究通過(guò)復(fù)制大鼠心肌缺血再灌注損失實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討葛根素?duì)缺血再灌注心肌脂質(zhì)過(guò)氧化和ERS的影響。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 健康雄性SD大鼠24只（重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），葛根素注射液（浙江康恩貝制藥股份有限公司），PCR試劑盒（北京天根產(chǎn)品），總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司），丙二醛（Malondialdehyde， MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase， SOD）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 雄性SD大鼠24只按照隨機(jī)數(shù)字表法分成三組，每組8只。假手術(shù)組（SH組）：開(kāi)胸后，在冠狀動(dòng)脈左前降支下穿線(xiàn)但不結(jié)扎，在穿線(xiàn)前15 min經(jīng)頸靜脈注射生理鹽水（2.5 mL/kg），連續(xù)觀察150 min。缺血再灌注組（I/R組）：在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支前15 min經(jīng)頸靜脈注射生理鹽水（2.5 mL/kg），結(jié)扎30 min，再開(kāi)放120 min[5-6]。葛根素預(yù)處理組（PU組）：結(jié)扎前15 min經(jīng)頸靜脈注射Pue（2.5 mL/kg），余同I/R組[7]。

1.3 測(cè)定指標(biāo) 將心肌細(xì)胞研磨成勻漿，以3000 rpm離心15 min，吸取上清液置管封存冷凍。運(yùn)用硫代巴比妥酸法測(cè)定心肌組織MDA含量，分光光度計(jì)法測(cè)定心肌組織SOD活性，并參考文獻(xiàn)[7]行RT-PCR檢測(cè)心肌組織葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和鈣網(wǎng)蛋白（CRT）mRNA的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葛根素預(yù)處理對(duì)心肌MDA、SOD水平的影響 與SH組比較，其余兩組心肌MDA含量顯著增多，SOD水平明顯降低（P＜0.05）。與I/R組比較，PU組心肌MDA含量減少，SOD活性升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 葛根素預(yù)處理對(duì)心肌MDA、SOD和GRP78 mRNA、CRT mRNA表達(dá)水平的影響（±s）

表1 葛根素預(yù)處理對(duì)心肌MDA、SOD和GRP78 mRNA、CRT mRNA表達(dá)水平的影響（±s）

*與SH組比較，P＜0.05；△與I/R組比較，P＜0.05.

組別 MDA（nmol/mgprot） SOD（U/mgprot） GRP78 mRNA CRT mRNA SH組（n=8） 0.76±0.21 54.25±3.39 0.59±0.05 0.56±0.04 I/R組（n=8） 1.12±0.42* 35.27±5.74* 0.96±0.07* 0.91±0.05*PU組（n=8） 0.89±0.35*△ 45.03±4.16*△ 0.77±0.06*△ 0.72±0.06*△

2.2 葛根素預(yù)處理對(duì)心肌GRP78、CRT mRNA水平的影響 與SH組比較，I/R組、PU組GRP78、CRT mRNA表達(dá)水平均增高（P＜0.05）；與I/R組比較，PU組GRP78、CRT mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

氧自由基大量產(chǎn)生并通過(guò)過(guò)氧化反應(yīng)造成組織細(xì)胞損傷是I/R損傷的主要機(jī)制之一，主要損害為細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物，使生物膜結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重?fù)p害。MDA是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，是反映體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要指標(biāo)之一，其含量多少可反映細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，可間接反映細(xì)胞損傷程度[8]。SOD是廣泛存在于需氧物體內(nèi)的一種金屬酶，能催化超氧陰離子自由產(chǎn)生歧化反應(yīng)，是體內(nèi)最為重要的自由基清除劑[9]。研究表明葛根素可減輕心肌脂質(zhì)過(guò)氧化和鈣超載損失，提高氧自由基清除能力，改善組織微循環(huán)，提高心肌細(xì)胞能源儲(chǔ)備達(dá)到對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)顯示，與I/R組比較，PU組脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA生成減少、自由基清除酶SOD活性上調(diào)，提示葛根素可減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器之一，在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、折疊、降解和分泌，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等方面具有重要作用。I/R過(guò)程中由于鈣超載、脂質(zhì)過(guò)氧化、缺氧等多種因素均可致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的聚集、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等，即觸發(fā)ERS[1]。ERS可通過(guò)三條信號(hào)途徑誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，其中未折疊蛋白反應(yīng)途徑（unfolded protein response，UPR）是發(fā)現(xiàn)較早、了解較多的一條ERS途徑，UPR是由一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78和3個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白所傳導(dǎo)的。ERS時(shí)，使GRF78從3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白上解離，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積的未折疊蛋白結(jié)合，促進(jìn)其折疊和降解。GRF78解離后，使無(wú)活性的ER應(yīng)激感受蛋白被激活并啟動(dòng)UPR，進(jìn)一步減少未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能的恢復(fù)。3個(gè)ER應(yīng)激感受蛋白不僅能夠啟動(dòng)ERS的生存途徑，嚴(yán)重或長(zhǎng)時(shí)間的ERS將誘發(fā)細(xì)胞凋亡途徑，加速細(xì)胞凋亡[1]。GRP78 是ERS的標(biāo)志性分子伴侶蛋白，其急速上調(diào)被認(rèn)為是ERS最敏感的標(biāo)志[10]。CRT是ER內(nèi)重要的鈣結(jié)合蛋白，參與協(xié)助蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及正確折疊，維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、減輕細(xì)胞凋亡等[11]。本研究顯示，I/R組與PU組均使GRP78和CRT mRNA表達(dá)上調(diào)，而PU組升高幅度較I/R組低，即PU組可誘導(dǎo)GRP78和CRT mRNA表達(dá)輕度增加，表明葛根素預(yù)處理可減輕I/R導(dǎo)致的過(guò)度ERS，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞損失。

研究表明應(yīng)用外源性SOD和過(guò)氧化氫酶作用于大鼠I/R心肌，發(fā)現(xiàn)其可改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，提高細(xì)胞對(duì)鈣的處理能力，表明抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能、減輕過(guò)度ERS的一種重要機(jī)制[12]。而本研究顯示，PU組脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA生成減少、自由基清除酶SOD活性上調(diào)，且GRP78和CRT mRNA表達(dá)輕度增加，表明葛根素預(yù)處理可能通過(guò)減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，緩解I/R激發(fā)的過(guò)度ERS。

綜上所述，葛根素預(yù)處理可能通過(guò)減輕心肌脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，抑制I/R導(dǎo)致的過(guò)度ERS而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

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Effects of Puerarin on Ischemia/Reperfusion Myocardial Lipid Peroxidation and Endoplasmic Reticulum Stress in Rats

/FENG Yi，MA Ya-fei，ZHANG Lin-bo，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（08）：011-012

Objective：To investigate the effect of endoplasmic reticulum stress （ERS） and apoptosis during myocardium ischemia reperfusion with Puerarin preconditioning in rats.Method：Twenty-four Male SD rats were divided randomly into three groups（n=8），sham operation group（SH），ischemia reperfusion group（IR） and Puerarin preconditioning group（PU）.The myocardial injury of rats ware produced by the ligation of left coronary artery for 30 min followed by 120 min reperfusion.The Malondialdehyde （MDA）， Superoxide Dismutase（SOD）， glucose-regulated protein 78 （GRP78） mRNA and calreticulin （CRT） mRNA were measured at the end of reperfusion.Result：Compared with the SH group， the expressions of MDA， GRP78 and CRT mRNA of the other two groups increased significantly （P＜0.05）， while the level of SOD decreased markedly （P＜0.05）. Compared with the I/R group， the level of MDA， GRP78 and CRT mRNA were significantly lower in PU group （P＜0.05）， while the level of SOD increased significantly（P＜0.05）.Conclusion：Preconditioning with puerarin may regulate ERS response and inhibit excessive ERS by reducing lipid peroxidation during myocardial ischemia reperfusion.

Puerarin； Ischemia-reperfusion； Endoplasmic reticulum stress； Lipid peroxidation

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.08.005

2013-11-11） （本文編輯：黃新珍）

①河南科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院 河南 洛陽(yáng) 471000

馬亞飛

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology，Luoyang 471000，China