吳樹彬，鄒麗華，劉晉萍，吉冰洋，唐 躍，吳愛麗，戚家峰，龍 村

·基礎(chǔ)研究·

改良下半身停循環(huán)聯(lián)合選擇性腦灌注兔模型的建立

吳樹彬，鄒麗華，劉晉萍，吉冰洋，唐 躍，吳愛麗，戚家峰，龍 村

目的探討建立心臟停跳的改良下半身停循環(huán)聯(lián)合選擇性腦灌注兔模型的可行性。方法隨機(jī)選取26只新西蘭兔，平均體重3.0 kg，15～20周齡。13只用于建立模型，另13只作為供血兔。經(jīng)右鎖骨下動脈和右心房插管建立體外循環(huán)（CPB），左鎖骨下動脈置管于主動脈根部，在CPB降溫至28℃時灌注St.Thomas液。降至肛溫20℃時停循環(huán)，行選擇性腦灌注60 min。圍CPB期于4個時點采集血流動力學(xué)指標(biāo)和檢測動脈血?dú)?，記錄?shù)值。結(jié)果1只動物死于主動脈破裂，其余12只均順利完成實驗。血流動力學(xué)和血?dú)庵笜?biāo)總體符合CPB的病理生理過程。結(jié)論該改良下半身停循環(huán)聯(lián)合選擇性腦灌注兔模型安全、穩(wěn)定，可用于心、腦等器官保護(hù)機(jī)制的研究。

低溫停循環(huán)；選擇性腦灌注；臟器保護(hù)；動物模型

在大腦血流紊亂時，降低溫度可維持大腦的代謝需求。因此，深低溫停循環(huán)被視為成人主動脈弓部手術(shù)中的一門關(guān)鍵技術(shù)。隨著外科技術(shù)不斷提高，停循環(huán)時間有所縮短，而低溫帶來的副作用逐漸得到關(guān)注，一些有經(jīng)驗的心血管中心也開始盡可能的避免深低溫，中低溫和淺低溫停循環(huán)也逐漸應(yīng)用于臨床，但何種停循環(huán)溫度對于大腦等器官保護(hù)較佳仍是研究者關(guān)注的焦點。

目前，構(gòu)建體外循環(huán)的動物模型集中在豬、犬和羊等大動物［1－2］，但大動物個體間同源性較差，且不經(jīng)濟(jì)。小動物如大鼠由于外科操作難度大，選擇性腦灌注這一技術(shù)至今未能實現(xiàn)。新西蘭兔作為中型動物，價格低廉，便于外科操作，并具有和人類大腦相似的Willis環(huán)［3］，適于低溫停循環(huán)下的腦保護(hù)及其作用機(jī)制研究，受到了研究者的青睞。但目前兔的停循環(huán)主要依靠深低溫心臟室顫而不是灌注心臟停搏液［4－5］，限制了不同溫度停循環(huán)下機(jī)體重要臟器保護(hù)的研究。本研究擬結(jié)合國內(nèi)外的研究進(jìn)展，探索采用心臟停搏液控制兔下半身停循環(huán)聯(lián)合選擇性腦灌注模型的建立，為研究不同溫度停循環(huán)下臟器保護(hù)提供新的平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。15～20周齡新西蘭兔26只，2.5～3.5 kg，雌雄不限；其中13只建立模型，另外13只作供血用。術(shù)前6 h禁食，2 h禁水。1.2 主要實驗耗材與儀器 14 F靜脈插管（美國Medtronic Inc，型號：66114），中心靜脈管（中國深圳益心達(dá)醫(yī)學(xué)新技術(shù)有限公司，型號：SCW－CVCP－1），膜肺（日本Terumo公司，型號：Terumo Capiox RW05 Baby－RX），16G／18G／20G動脈套管針，7－0 prolene縫線，輸液器，尿液引流瓶，3.5＃氣管插管。呼吸機(jī)（巴西INTERMED公司，型號：Class 1－Type B），雙頭滾壓泵（德國Stockert公司），變溫水箱（德國Jostra公司，型號：20－600），變溫毯等。

1.3 體外循環(huán)管道 整體管道由回流室（50 ml注射器），硅膠輸液管道，泵管，膜肺，變溫水箱，雙頭滾壓泵，14 F靜脈插管及引流管組成。預(yù)充液組成：60 ml供血兔血液，琥珀酰明膠注射液（沈陽貝朗制藥有限公司）10 ml，復(fù)方電解質(zhì)注射液（上海百特醫(yī)療用品有限公司）10 ml。肝素鈉注射液（天津藥業(yè)焦作有限公司）100 U、呋塞米注射液（鄭州羚銳制藥有限公司）3 mg、5%NaHCO3注射液（天津藥業(yè)焦作有限公司）5 ml加入到預(yù)充液中。

1.4 麻醉及外科準(zhǔn)備 隨機(jī)選取實驗用新西蘭兔，稱重。鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業(yè)有限公司）35 mg／kg和地西泮（安徽省皖北藥業(yè)股份有限公司）1.5 mg／kg經(jīng)耳緣靜脈誘導(dǎo)麻醉，于仰臥位將兔四肢固定于鋪有變溫毯的外科操作臺。經(jīng)口氣管插管，連接呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)呼吸參數(shù)：呼吸頻率為40～60次／min、潮氣量為7～10 ml／kg，吸呼比為1∶2，氧流量0.5～1 L／min。給予0.1 mg／kg維庫溴銨（浙江仙琚制藥股份有限公司）維持肌松，氯胺酮10 mg／（kg·h）和地西泮1.5 mg／（kg·h）維持術(shù)中麻醉。四肢連接心電圖導(dǎo)聯(lián)進(jìn)行心電監(jiān)測；置肛溫探頭進(jìn)行體溫監(jiān)測；右股動脈置入20 G動脈套管針，監(jiān)測平均動脈壓；膀胱造瘺，荷包縫合18 G動脈套管針引流尿液。全身肝素化（500 U／kg）后，胸部正中切口暴露心臟和升主動脈，沿主動脈游離無名動脈及左、右鎖骨下動脈，右鎖骨下動脈置入16 G動脈套管針供全身灌注或選擇性腦灌注。中心靜脈管置入左鎖骨下動脈，在動脈鞘管導(dǎo)絲引導(dǎo)下，送至主動脈根部，供灌注心臟停搏液。右心耳處做切口，荷包縫合14 F靜脈插管，連接引流管，并暫時夾閉，供引流靜脈血，將回流室與動物心臟水平垂直距離維持在35～40 cm。主動脈根部套Ⅰ號阻斷帶備用，左鎖骨下動脈與無名動脈之間套Ⅱ號阻斷帶備用。值得注意的是，新西蘭兔主動脈弓部的動脈血管解剖與人類有較大差異，多數(shù)動物的左頸總動脈起源于無名動脈而非主動脈弓部，見圖1。

圖1 兔仰臥位頸胸部主要血管及體外循環(huán)示意圖

1.5 體外循環(huán)方法 體外循環(huán)管道預(yù)充排氣后，打開靜脈引流管，同時開啟雙頭滾壓泵，開始體外循環(huán)。全流量設(shè)為100～120 ml／（kg·min），平均動脈壓維持在40～60 mm Hg。于轉(zhuǎn)機(jī)10 min后啟用變溫水箱降溫，降至28℃時夾閉Ⅰ號阻斷帶，降溫過程中未出現(xiàn)室顫。開啟雙頭泵另一泵頭灌注St.Thomas液20 ml／kg，此后，主動脈阻斷每隔30 min時灌注停搏液半量，心臟停跳后在心臟周圍以冰屑冷敷。繼續(xù)降溫至20℃時，調(diào)整灌注泵速，將流量降至8～10 ml／（kg·min），同時夾閉Ⅱ號阻斷帶，開始下半身停循環(huán)并行選擇性腦灌注，將冰袋置于動物皮膚表面維持低溫。停循環(huán)1 h后，打開Ⅱ號阻斷帶，恢復(fù)全身灌注，打開變溫毯和調(diào)整變溫水箱溫度開始復(fù)溫，肛溫與變溫水箱溫度差低于5℃。復(fù)溫至32℃時，打開I號阻斷帶，心臟自動復(fù)跳，若出現(xiàn)房、室顫則電復(fù)律。繼續(xù)復(fù)溫至35℃時停機(jī)，并于停機(jī)后2 h以安樂死處置動物。整個轉(zhuǎn)機(jī)過程采用α穩(wěn)態(tài)血?dú)夤芾怼?/p>

1.6 實驗數(shù)據(jù)采集 體外循環(huán)各時段所用時間；分別于麻醉后、降溫至28℃、開放升主動脈后10 min和停機(jī)后10 min四個時間點采集血流動力學(xué)指標(biāo)并檢測動脈血?dú)狻?/p>

1.7 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。對四個時點數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)間應(yīng)用LSD（最小顯著差值法）檢驗；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 手術(shù)及體外循環(huán) 轉(zhuǎn)機(jī)、主動脈夾閉、降溫和復(fù)溫時間分別為（208.25±30.62）min、（130.42±11.56）min、（50.75±11.66）min、（69.00±10.95）min。復(fù)溫過程中1只動物因主動脈破裂大出血死亡，原因是所置導(dǎo)管過深損傷了主動脈壁，在體外循環(huán)灌注壓力的不斷刺激下導(dǎo)致破裂。其它12只動物均自動復(fù)跳，其中2只動物在停機(jī)后出現(xiàn)血壓下降，微量泵持續(xù)泵入多巴胺5 μg／（kg·min）和去甲腎上腺素0.04 μg／（kg·min）可維持血壓在50～65 mm Hg，直到動物安樂死。10只動物自動復(fù)跳后血壓可自行維持在45 mm Hg以上。1只動物在自動復(fù)跳后發(fā)生心房顫動，電復(fù)律后心臟恢復(fù)正常節(jié)律。

2.2 血流動力學(xué)與血?dú)獗O(jiān)測 監(jiān)測數(shù)據(jù)見表1。平均動脈壓（MAP）降溫至28℃、開升主10 min和停機(jī)后10 min三個時點比麻醉后低（P＜0.05），開升主10 min和停機(jī)10 min后MAP無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但較降溫至28℃時高（P＜0.05）。

心率（HR）降溫至28℃、開升主10 min及停機(jī)10 min三個時點無明顯差異（P＞0.05），但降溫至28℃和開升主10 min兩個時點較麻醉后低（P＜0.05），麻醉后與停機(jī)后無明顯差異（P＞0.05）。

氧分壓（PaO2）降溫至28℃時較其它三個時點高（P＜0.05），開升主10 min高于麻醉后和停機(jī)后10 min（P＜0.05），麻醉后和停機(jī)后10min無明顯差異（P＞0.05）。

動脈氧飽和度（SaO2）四個時點無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

pH值與停機(jī)后10 min相比，麻醉后、降溫至28℃和開升主10 min三個時點較高（P＜0.05），降溫至28℃和開升主10 min時較麻醉后高（P＜0.05），但降溫至28℃和開升主10 min兩個時點無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。

血紅蛋白（Hb）濃度麻醉后較降溫至28℃、開升主10 min和停機(jī)后10 min三個時點高（P＜0.05），且這三個時點無明顯差異（P＞0.05）。

乳酸（Lac）值四個時點的兩兩之間均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

3 討 論

神經(jīng)功能障礙是深低溫停循環(huán)后最常見的并發(fā)癥之一，選擇性腦灌注技術(shù)應(yīng)用于臨床后改善了患者神經(jīng)預(yù)后，但同時給臨床帶來了新的變革，即停循環(huán)溫度趨向“暖化”。低溫作為停循環(huán)期間重要的保護(hù)措施，可以抑制大腦代謝、減少興奮性氨基酸釋放、削弱氧化應(yīng)激程度和降低大腦缺血后炎癥反應(yīng)［6］。但同時，它也會打破機(jī)體穩(wěn)態(tài)、導(dǎo)致微循環(huán)功能障礙和心肌收縮功能障礙［7］。因此，不同溫度下停循環(huán)的最佳腦灌注流量仍然是一個值得深入研究的課題。深低溫、中低溫和淺低溫停循環(huán)中何種管理方式能更好的保護(hù)大腦，減輕心肌功能障礙等損傷，是一個值得探討的問題。

本研究克服了國內(nèi)外目前深低溫停循環(huán)兔模型中的關(guān)鍵難題，成功的將心肌灌注和選擇性腦灌注技術(shù)合為一體，建立了成功率高、貼近臨床的動物模型，為研究上述難題提供了便利。

3.1 模型的建立方法

3.1.1 插管及插管位置的選擇 研究選擇了右鎖骨下動脈灌注全身和下半身停循環(huán)期間灌注大腦，只需調(diào)控一個泵頭流量就可以滿足兩個部位的灌注，節(jié)約了外科手術(shù)操作過程，降低了手術(shù)導(dǎo)致的并發(fā)癥。選擇左鎖骨下動脈置中心靜脈管于主動脈根部灌注心臟停搏液是本研究的一個創(chuàng)新點：首先，管道足夠細(xì)，幾乎不會影響全身灌注，并可滿足心肌灌注；其次，管道足夠長、軟，為其走行于有弧度的弓部血管提供了便利；再次，管道特配有柔韌有余的導(dǎo)絲，導(dǎo)絲牽引為其順利置于主動脈根部提供了保障。另外，選擇14 F靜脈插管荷包縫合于右心房引流靜脈血是本研究的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。14 F靜脈插管（內(nèi)徑4.7 mm）不僅管徑足夠大，而且管道頭端備有專業(yè)設(shè)計的引流孔，為通暢引流靜脈血和建立體外循環(huán)打下了良好的基礎(chǔ)。

表1 轉(zhuǎn)流過程中各時點血?dú)獗容^（±s）

表1 轉(zhuǎn)流過程中各時點血?dú)獗容^（±s）

注：＃與麻醉后比較P＜0.05；△與降溫至28℃比較P＜0.05；?與開升主10 min比較P＜0.05。

項目 麻醉后 降溫至28℃ 開升主10 min 停機(jī)10 min MAP（mm Hg） 80.83±8.01 55.58±9.25＃66.92±13.48?！?5.92±14.85?！鱄R（bpm） 236.92±18.61 195.33±36.16＃197.13±40.48＃213.67±17.52 PaO2（mm Hg） 245.97±45.94 490.96±70.96＃411.20±56.83?！?51.63±43.43?△SaO2（%） 99.28±2.01 99.89±0.03 99.88±0.06 99.62±0.32 pH 7.28±0.08 7.40±0.13＃7.40±0.16＃7.17±0.09??！鱄b（g／L） 93.67±17.03 69.67±13.23＃75.75±14.40＃77.75±21.54＃Lac（mmol／L） 4.41±0.72 5.17±0.48＃7.48±0.64?！?.83±0.44??！?/p>

3.1.2 膀胱造瘺 這是本次研究的另一關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。在目前的國內(nèi)體外循環(huán)兔模型中，尚未見膀胱造瘺這一操作的應(yīng)用。雖然，依靠較高的膀胱充盈壓能夠使尿液溢出體外，但高膀胱充盈壓會影響腎臟濾過作用，導(dǎo)致血液稀釋。通過將剪有側(cè)孔的18 G套管針荷包縫合于膀胱，并結(jié)合利尿藥的使用，實現(xiàn)了體外循環(huán)中免用血液濾器，就可將Hb維持在較高的濃度，不僅減少了體外循環(huán)耗材的使用，還避免了機(jī)體內(nèi)許多有益成分的丟失。

3.1.3 預(yù)充 本研究預(yù)充量較?。?0 ml），但因需灌注St.Thomas心臟停搏液20 ml／kg，會導(dǎo)致血液進(jìn)一步稀釋，因此，采用了供血兔的血液預(yù)充，較好的維持了轉(zhuǎn)流中的Hb濃度。另外，兔血液高凝，注意平衡抗凝。

3.2 實驗數(shù)據(jù)分析 MAP和HR在四個時點的變化比較符合體外循環(huán)病理生理過程。PaO2在轉(zhuǎn)流過程中較高，維持了較好的SaO2，側(cè)面反映了膜肺的氧合性能良好。麻醉后和停機(jī)后10 min PaO2無統(tǒng)計學(xué)意義，暗示了停機(jī)后10 min動物呼吸功能狀態(tài)良好。Hb在轉(zhuǎn)流后由于血液稀釋，出現(xiàn)明顯下降，但在轉(zhuǎn)流過程中通過添加供血兔的血液和使用利尿劑，使Hb維持在一個相對較高的水平。麻醉后動脈血pH均值為7.28，略偏酸性，轉(zhuǎn)流過程中采取了α穩(wěn)態(tài)血?dú)夤芾?，pH值恢復(fù)正常范圍內(nèi)，但可能因為停循環(huán)期間血液重新分布、無氧代謝等因素產(chǎn)生的Lac未被代謝完全和機(jī)體尚存在未完全糾正的代謝性酸中毒，從而在停機(jī)后10 min出現(xiàn)一定程度的pH值降低。

新西蘭兔Lac值與人類有較大的差異，其基礎(chǔ)值在4～6 mmol／L之間［8］。Lac值在降溫至28℃時明顯較基礎(chǔ)值高，可能是轉(zhuǎn)流開始后血液稀釋和血液溫差增加了機(jī)體的無氧代謝。開放升主后10 min Lac值急劇升高，可能是因為低溫停循環(huán)會導(dǎo)致血液向骨骼肌的重新分布，導(dǎo)致體內(nèi)臟器血流降低，增加無氧代謝，Lac產(chǎn)生增加；肝臟是Lac轉(zhuǎn)化的主要器官，低溫下酶活性降低導(dǎo)致其清除率降低［9］。此外，復(fù)溫期間耗氧量增加及微循環(huán)功能紊亂，也是Lac進(jìn)一步升高的重要原因。停機(jī)后10 min Lac明顯降低，可能與利尿劑的應(yīng)用及升主開放后機(jī)體自身微循環(huán)的改善密切相關(guān)。盡管新西蘭兔的Lac與人類差異較大，但對于1 h深低溫停循環(huán)，其Lac增長幅度仍在可接受的范圍內(nèi)，其變化趨勢與臨床比較相符。

3.3 研究局限 本實驗中缺少對全身灌注和心肌灌注壓力的測量，但是血?dú)夥治龊脱鲃恿W(xué)監(jiān)測結(jié)果表明，全身灌注效果較好。動物在心臟平均停循環(huán)130 min后仍可自動復(fù)跳，并且停機(jī)后多數(shù)動物血壓可自行維持50 mm Hg以上，暗示在低溫和心臟停搏液的作用下，心肌保護(hù)效果較好，并沒有因為灌注壓力高而導(dǎo)致心肌或血管損傷。

總體來說，本研究成功建立了心臟停跳的改良下半身停循環(huán)聯(lián)合選擇性腦灌注兔模型。與之前建立的模型相比，該模型更加貼近臨床，為研究不同溫度停循環(huán)下心、腦及其它臟器保護(hù)作用及機(jī)制提供了新的平臺。

［1］ Chen Y，Liu J，Ji B，et al.The optimal flow rate for antegrade cerebral perfusion during deep hypothermic circulatory arrest ［J］.Artif Organs，2012，36（9）：774－779.

［2］ Leroux AA，Moonen ML，Pierard LA，et al.Animal models of mitral regurgitation induced by mitral valve chordae tendineae rupture［J］.J Heart Valve Dis，2012，21（4）：416－423.

［3］ Safar P.Long－term animal outcome models for cardiopulmonarycerebral resuscitation research［J］.Crit Care Med，1985，13 （11）：936－940.

［4］ 楊九光，龍村，姚忠喜，等.經(jīng)右鎖骨下動脈、右房插管兔體外循環(huán)及選擇性腦灌注模型的建立 ［J］.中華實驗外科雜志，2000，17（1）：77－78.

［5］ 唐躍，吳愛麗，慎慧，等.兔深低溫停循環(huán)體外循環(huán)模型的建立［J］.實驗動物科學(xué)，2009，26（6）：76－77.

［6］ Dave KR，Christian SL，Perez－Pinzon MA，et al.Neuroprotec?tion：lessons from hibernators［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2012，162（1－3）：1－9.

［7］ Howell NJ，Ashrafian H，Drury NE，et al.Glucose－insulin－po?tassium reduces the incidence of low cardiac output episodes after aortic valve replacement for aortic stenosis in patients with left ventricular hypertrophy：results from the Hypertrophy，Insulin，Glucose，and Electrolytes（HINGE）trial［J］.Circulation，2011，123（2）：170－177.

［8］ Lin Y，Leach WJ，Ammons WS.Synergistic effect of a recombi?nant N－terminal fragment of bactericidal／permeability－increasing protein and cefamandole in treatment of rabbit gram－negative sep?sis［J］.Antimicrob Agents Chemother，1996，40（1）：65－69.

［9］ Li J，Schulze－Neick I，Lincoln C，et al.Oxygen consumption after cardiopulmonary bypass surgery in children：determinants and implications［J］.J Thorac Cardiov Sur，2000，119（3）：525 －533.

Establishment of a modified lower body circulatory arrest and selective cerebral perfusion model in rabbits

Wu Shu－bin，Zou Li－h(huán)ua，Liu Jin－ping，Ji Bing－Yang，Tang Yue，Wu Ai－li，Qi Jia－feng，Long Cun
Department of Cardiopulmonary Bypass，State Key Laboratory of Cardiovascular Disease and Fuwai Hospital Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100037，China

Liu Jin－ping，Email：jinpingfw＠hotmail.com

ObjectiveTo explore the feasibility of establishing a modified lower body circulatory arrest and selective cerebral perfusion model in rabbits.MethodsTwenty six rabbits were selected randomly.The mean weight and age of the rabbits were 3.0 kg and 15－20 weeks respectively.Half of them were used to model establishment，and the rest blood donation.Cardiopulmonary bypass was established via right subclavian artery and right artrium cannulation.Catheter was cannulated from left subclavian artery to arotic root for St.Thomas fluid perfusion at 28℃.Rabbits undergone 60 min of the lower body circulatory arrest and selective cerebral perfu?sion at a rectal temperature of 20℃.Blood gas and hemodynamic parameters were measured in four time points during cardiopulmonary bypass.ResultsOf the thirteen rabbits，one died of aortic rupture and the others survived during the experiment.Blood gas and hemo?dynamic parameters were in accordance with the pathophysiological process of cardiopulmonary bypass generally.ConclusionThe model is safe and stable，and could be used to study the protective mechanism of heart，brain and the other organs under circulatory ar?rest and selective cerebral perfusion.

Hypothermia circulatory arrest；Selective cerebral perfusion；Organs protection；Animal model

2013?10?14）

2014?01?07）

10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2014.01.13

國家自然科學(xué)基金（81100178）

100037北京，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，阜外心血管病醫(yī)院體外循環(huán)科［吳樹彬（研究生）、鄒麗華（研究生）、劉晉萍、吉冰洋、龍 村］，動物實驗中心（唐躍、吳愛麗）；154002佳木斯，佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科（戚家峰）

劉晉萍：Email：jinpingfw＠hotmail.com