李佳丹，易軍，陳江，田洪榛，陳光輝

·基礎(chǔ)研究·

脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠心肌梗死后心功能的保護(hù)作用

李佳丹，易軍，陳江，田洪榛，陳光輝

目的探討脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）對(duì)大鼠急性心肌梗死（AMI）后心功能的影響。方法 結(jié)扎SD大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支制備心肌梗死模型。同種異體ADSCs體外分離、培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增，在大鼠AMI區(qū)域周圍進(jìn)行心外膜下移植。將24只大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只：A組為AMI模型組，只給予前降支結(jié)扎；B組為細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）移植組，結(jié)扎后心外膜注射DMEM；C組為ADSCs治療組，結(jié)扎前降支后接受ADSCs移植治療。術(shù)后7 d、28 d各組大鼠行心臟超聲檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（FS），28 d超聲檢測(cè)后行血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量左室收縮壓、左室舒張末壓、左心室壓力最大變化速率，評(píng)價(jià)ADSCs移植對(duì)AMI后大鼠心功能的影響；心臟組織行TTC染色，觀察AMI面積。結(jié)果與AMI模型組比較，ADSCs治療組的LVEF、FS及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)明顯提高（P＜0.01）。TTC染色觀察心肌梗死面積，ADSCs治療組心肌梗死面積明顯減小（P＜0.01）。結(jié)論 ADSCs可減少AMI的面積，改善心功能。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；急性心肌梗死；心功能；大鼠

在心血管疾病研究領(lǐng)域，心肌梗死已成為全球性的醫(yī)學(xué)難題。當(dāng)發(fā)生心肌梗死時(shí)，大量心肌細(xì)胞喪失，并繼以瘢痕組織形成，嚴(yán)重影響了心臟的收縮和舒張功能，長(zhǎng)期的過程導(dǎo)致了慢性心力衰竭。而目前的治療手段只能改善部分臨床癥狀，心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生率仍較高，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量和生存率。心肌細(xì)胞的凋亡和壞死形成不可逆損傷，是導(dǎo)致急性心肌梗死（acute myocardial in?farction，AMI）后心力衰竭的主要原因，在此種情況下，心肌細(xì)胞的修復(fù)日益得到關(guān)注。

干細(xì)胞具有自我更新和定向分化能力，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛和深入的研究，并開始應(yīng)用于AMI的治療及AMI后心衰的預(yù)防［1－3］。2001年Zuk等［4］成功分離出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose－de?rived mesenchymal stem cells，ADSCs），較其他來源的干細(xì)胞，其來源廣泛，取材方便，可大量擴(kuò)增，低免

疫原性，無免疫排斥及倫理問題，而成為理想的治療心肌損傷的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行同種異體ADSCs移植治療大鼠心肌梗死模型，觀察ADSCs對(duì)大鼠心功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 將24只大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只：A組為AMI模型組；B組為細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）移植組；C組為ADSCs治療組。清潔級(jí)SD大鼠由解放軍醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。Ⅱ型膠原酶（Gibco）、L－DMEM培養(yǎng)基（Gibco）、特級(jí)胎牛血清（Gibco）。

1.2 ADSCs的分離培養(yǎng) SD乳鼠（3～5 d）5只，雌雄不限，無菌條件下取乳鼠肩胛及腹股溝皮下脂肪，PBS清洗2～3次，剪成云霧狀，1%Ⅱ型膠原酶置于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)震蕩消化40 min后，加入含10%胎牛血清的DMEM中和膠原酶。200目篩網(wǎng)過濾兩次，管內(nèi)離心（1 500 r，10 min），棄上清，完全DMEM接種，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，24 h后首次換液，去除未貼壁的細(xì)胞，隨后2～3 d換一次液。鏡下觀察培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，加入0.25%＋0.04%乙二胺四乙酸（EDTA）進(jìn)行消化，以1∶3進(jìn)行傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 AMI模型的建立 大鼠稱重，2%戊巴比妥鈉（0.2 ml／100 g）腹腔麻醉，分離氣管，行氣管插管，調(diào)節(jié)微型動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸頻率55次／min，潮氣量30 ml／kg，呼吸比2∶1，于大鼠第3、4肋間豎行剪開皮膚，鈍性分離肌肉組織，開胸，暴露心臟，剪開心包，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處下1～2 mm結(jié)扎前降支，造成左室前壁心肌梗死（左室前壁心肌組織搏動(dòng)減弱，顏色蒼白，心電圖顯示ST段弓背抬高示結(jié)扎成功）。

1.4 ADSCs移植 AMI模型制作成功后，待大鼠呼吸、心律平穩(wěn)，用1 ml注射器于梗死區(qū)與正常心肌交界處4點(diǎn)注射100 ul細(xì)胞懸液（約1×106／100 ul），DMEM移植組同樣方式注射 100 ul無血清DMEM，待大鼠各項(xiàng)指標(biāo)平穩(wěn)后，進(jìn)行縫合，術(shù)后給予青霉素腹腔注射抗感染。

1.5 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 移植后7 d、28 d，各組心臟超聲檢測(cè)，測(cè)量左心室收縮末期直徑（LVESD）、左心室舒張末期直徑（LEVDD）；計(jì)算左室短軸縮短率（FS）以及射血分?jǐn)?shù)（EF）。采集3～6個(gè)心動(dòng)周期測(cè)量的數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值。

1.6 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)后，進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。大鼠稱重，2%戊巴比妥鈉（0.2 ml／

100g）進(jìn)行腹腔麻醉。頸部正中切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露右頸總動(dòng)脈，鈍性分離約1.5～2 cm右頸總動(dòng)脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端以動(dòng)脈夾夾住。動(dòng)脈夾與結(jié)扎點(diǎn)之間的動(dòng)脈上剪開V型切口，將連接測(cè)壓器的導(dǎo)管經(jīng)動(dòng)脈上的切口插入，松開動(dòng)脈夾，將導(dǎo)管插入到左心室，記錄動(dòng)物心功能參數(shù)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、FS、左心室收縮壓（LVSP），左心室舒張末期壓（LVEDP）以及左心室壓力最大變化速率（＋dp／dtmax）等。

1.7 組織化學(xué)染色 各組動(dòng)物完成心功能檢測(cè)后，立即開胸，取出心臟，用生理鹽水去血污，剔除血管脂肪等非心肌組織，用吸水紙吸取水分，將全心置于－20℃凍存5 min，從心尖至心底，按厚度分為五等份，TTC染色，觀察心肌梗死區(qū)域面積。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組比較采用方差分析，以P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs的培養(yǎng) 24 h換液后，原代細(xì)胞明顯貼壁，多為不規(guī)則或短梭形，之后逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形似成纖維細(xì)胞，成旋渦狀生長(zhǎng)，隨著換液和傳代，一些似內(nèi)皮樣的鋪路石樣的細(xì)胞逐漸消失，本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為第三代細(xì)胞，見圖1。

圖1 光鏡下第三代ADSCs

2.2 AMI模型的建立 結(jié)扎前降支后，左室前壁心肌組織搏動(dòng)減弱，顏色蒼白，此時(shí)心電圖可見R波振幅升高，ST段弓背向上抬高，表明AMI模型建立成功。

2.3 心功能檢測(cè) 與AMI模型組和DMEM移植組比較，ADSCs治療組心功能明顯改善，LVEF、FS、LVSP、LVEDP、＋dp／dt顯著升高（P＜0.01），AMI模型組與DMEM移植組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。移植后28 d的LVEF和FS與移植后7 d比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、表2。

2.4 TTC染色 大鼠處死后取出心臟，AMI模型組及DMEM組大鼠心臟擴(kuò)大，左室壁塌陷，室壁心肌被疤痕組織所替代，顏色灰白；ADSCs治療組大鼠

表1 大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果比較（n＝8，±s）

表1 大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果比較（n＝8，±s）

注：與AMI模型組比較，?P＜0.01；與DMEM移植組比較，＃P＜0.01。

分組 LVEF（%）FS（%）術(shù)后7 d 術(shù)后28 d 術(shù)后7 d 術(shù)后28 d AMI模型組 57.47±5.35 54.98±8.71 23.65±2.92 24.76±5.55 DMEM移植組 50.51±5.25 53.33±7.48 22.29±3.17 22.81±4.72 ADSCs治療組 67.91±4.17?＃71.66±5.05?＃33.26±2.79?＃36.04±3.64?＃

表2 大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

表2 大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

注：與AMI模型組比較，?P＜0.01；與DMEM移植組比較，＃P＜0.01。

分組 LVSP（mm Hg） LVEDP（mm Hg） ＋dp／dt（mm Hg／s）AMI模型組（n＝7） 74.1±7.87 17.63±3.51 2 364.23±568.14 DMEM移植組（n＝7） 69.12±8.91 19.48±4.50 2 223.27±517.24 ADSCs治療組（n＝8） 110.85±11.00?＃2.80±2.43?＃6 355.18±348.07?＃

圖2 大鼠心肌組織TTC染色

心臟不大，左室壁彈性良好，灰白區(qū)域較AMI組面積顯著較小（如圖2 A、B、C），圖像分析軟件分析，ADSCs治療組的梗死面積（18.40±3.65）%明顯低于AMI模型組（31.01±2.34）%及DMEM移植組（28.77±1.95）%，P＜0.01。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)制備SD大鼠模型過程中AMI模型組和DMEM移植組分別有1只動(dòng)物死亡，分析原因，可能為結(jié)扎位置過高，造成心肌梗死面積過大，大鼠心衰嚴(yán)重；心外膜下移植DMEM過程中，影響左右束支傳導(dǎo)功能，造成惡性心律失常。將分離培養(yǎng)的同種異體ADSCs心外膜下移植于梗死區(qū)周圍，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)28 d時(shí)行血流動(dòng)力學(xué)檢查和心臟超聲檢查，結(jié)果顯示ADSCs治療組與AMI模型組和DMEM移植組相比，各項(xiàng)指標(biāo)明顯提高，而DMEM移植組與AMI模型組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明ADSCs對(duì)大鼠AMI后心功能有顯著改善作用。而在7 d、28 d的LVEF、FS相比較，無明顯差異，提示ADSCs在移植后一周內(nèi)的治療作用較明顯。28 d大鼠AMI面積的比較，AD?SCs治療組梗死面積明顯減小，ADSCs改善心功能的作用可能與其可減小AMI面積有關(guān)。

干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的研究已開展多年，目前研究和應(yīng)用最為深入和廣泛的為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［5］。但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在一些缺陷如：取材困難，患者較痛苦；取材部位局限，獲取細(xì)胞數(shù)量少。而ADSCs的出現(xiàn)克服了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的不足，成為理想的種子細(xì)胞。有研究人員證實(shí)了ADSCs與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似的表型和特性［6］，同時(shí)有研究結(jié)果表明ADSCs移植可促進(jìn)AMI區(qū)域的血管和神經(jīng)的再生，有效保護(hù)心功能，且移植細(xì)胞可存活至1個(gè)月，但沒有證據(jù)表明這些細(xì)胞可直接轉(zhuǎn)化為宿主的心肌組織而發(fā)揮治療作用［7］。盡管目前干細(xì)胞的移植治療作用存在爭(zhēng)議，但目前研究的主流結(jié)果仍然可以說明ADSCs在AMI治療中的積極作用［8－9］。目前ADSCs改善心功能的機(jī)制尚不明晰，Shah等人總結(jié)其機(jī)制主要為：血管再生、心肌再生、免疫調(diào)節(jié)，這三個(gè)方面可以減少心肌細(xì)胞凋亡和瘢痕組織的形成［10］。

ADSCs的優(yōu)越性給再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來了新的希望，且取得了一些進(jìn)展，但是細(xì)胞移植生存率低、移植方式的選擇及安全性等問題，仍是值得研究與關(guān)注的問題。

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The protection of adipose－derived mesenchymal stem cells on cardiac function after myocardial infarction in rats

Li Jia－dan，Yi Jun，Chen Jiang，Tian Hong－zhen，Chen Guang－h(huán)ui
Department of Cardiology，PLA General Hospital，Beijing 100853，China

Chen Guang－h(huán)ui，Email：chen kevin301＠m(xù)sn.com

ObjectiveTo investigate the effects of adipose－derived mesenchymal stem cells（ADSCs）transplanted on cardiac function after acute myocardial infarction in rats.MethodsThe model of acute myocardial infarction（AMI）was created by occluding the left anterior descending artery（LAD）in SD rats.Allogeneic ADSCs were isolated，purified，amplifed and conducted epicardial trans?plantation.The rats were randomly divided into 3 groups with 8 rats for each group.Group A was the model of AMI.Group B（control group）was injected DMEM.Group C received ADSCs treatment.After 1 and 4th week，cardiac ultrasound was inspected.After the in?spection of cardiac ultrasound at 4th week，index of hemodynamics were tested to evaluate the cardiac function.The area of myocardial in?farction wre calculated with TTC staining.ResultsCompared with AMI group，left ventricular ejection fraction，fractional shortening and index of hemodynamics of ADSCs group were significantly increased（P＜0.01），and the myocardial infarction area of ADSCs group was significantly lower（P＜0.01）.ConclusionADSCs can reduce area of myocardial infarction and improve the function of heart.

Adipose－derived stem cells；Acute myocardial infarction；Cardiac function；Rat

2013?10?18）

2013?11?04）

10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2014.01.15基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2011AA020101）作者單位：100853北京，中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科通訊作者：陳光輝，Email：chenkevin301＠m(xù)sn.com