魏 珂，敖 麗，劉 力，閔 蘇

·基礎(chǔ)研究·

內(nèi)源性神經(jīng)生長因子在大鼠心臟缺血再灌注急性期的表達(dá)變化

魏 珂，敖 麗，劉 力，閔 蘇

目的探討內(nèi)源性神經(jīng)生長因子（NGF）在大鼠心臟缺血再灌注過程中不同階段和不同部位表達(dá)的特點(diǎn)。方法

神經(jīng)生長因子；再灌注損傷；心??；大鼠

其功能包括促進(jìn)交感神經(jīng)元突觸的形成、生長，增加神經(jīng)纖維與心肌組織間連接的數(shù)量等［3］。部分研究還發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注（ischemia－reperfusion，I／R）過程中NGF的表達(dá)增加可對(duì)抗心肌缺血后交感神經(jīng)頓抑和心肌細(xì)胞凋亡［4］。本研究擬通過大鼠在體心臟觀察內(nèi)源性NGF在I／R過程中不同階段和不同區(qū)域的表達(dá)特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛300 mg／kg麻醉后，仰臥固定于鼠板上，術(shù)中通過熱板法維持肛溫37～38℃。連續(xù)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。氣管切開插管后連接TKR－200C小動(dòng)物呼吸機(jī)（江西省特力麻醉呼吸設(shè)備公司）行機(jī)械通氣，設(shè)定潮氣量為2～3 ml／100 g，F(xiàn) 80～90次／min，I／E 1∶1，氧流量0.5 L／min。分離左頸總動(dòng)脈，插管后連接YP100型壓力換能器（成都儀器廠）以及RM6240B型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）監(jiān)測左室內(nèi)壓力變化。打開胸腔，剪開心包后充分暴露心臟，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間找到左冠狀動(dòng)脈前降支（left anterior descending branch，LAD），6－0號(hào)細(xì)線穿過LAD的心肌表層，結(jié)扎時(shí)用一約2 mm長的橡膠圈墊于結(jié)扎線與血管之間。LAD結(jié)扎成功標(biāo)志：結(jié)扎線以下心肌組織發(fā)紺并活動(dòng)減弱，血壓下降，ECG顯示心肌梗死改變（ST段明顯抬高或壓低等）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 成年雄性SD大鼠24只，鼠齡8～10 w，體重250～300 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成三組（n＝8）：假手術(shù)組（S組）、缺血組（I組）和缺血再灌注組（I／R組）。S組開胸后于LAD下用細(xì)線穿過但不結(jié)扎，持續(xù)150 min；I組結(jié)扎LAD 30 min；I／R組結(jié)扎30 min后復(fù)灌120 min。各組術(shù)畢抽動(dòng)脈血測定生化指標(biāo)，取心肌標(biāo)本。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集及蛋白測定

1.3.1 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測 記錄缺血前（T0）、缺血30 min（T1）及再灌注120 min（T2）時(shí)各組大鼠心率（heart rate，HR），左室收縮壓（left ventricular systol?ic pressure，LVSP）和舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)頸總動(dòng)脈取血，離心后用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、肌酸激酶（creatine kinase－MB，CK?MB）試劑盒（上海滬尚生物科技有限公司）檢測血清中LDH、CKMB濃度。

1.3.3 免疫組化法檢測不同區(qū)域心肌NGF的表達(dá)I／R組再灌注120 min后取左心室前壁（即缺血區(qū)，IS區(qū)）和右心室（即非缺血區(qū)，NIS區(qū)）心肌組織經(jīng)過4%的多聚甲醛溶液固定、乙醇脫水、石蠟包埋制成表面積小于0.5 cm×0.5 cm的石蠟塊，再經(jīng)過切片、35℃水浴中展切、撈片后在30℃恒溫干燥箱中干燥48 h，干燥后的切片再經(jīng)過常規(guī)脫蠟、滅活內(nèi)源性酶后，分別滴加兔抗鼠NGF抗體、生物素標(biāo)記的山羊抗兔抗體，經(jīng)顯色、復(fù)染、再脫水，再透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察拍照，NGF定位于心肌細(xì)胞的胞漿，其陽性染色均呈棕黃色。高倍鏡下IS 和NIS區(qū)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，用Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析心肌NIS和IS區(qū)NGF陽性表達(dá)的平均光密度值，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。

1.3.4 Western－blot檢測NGF蛋白的表達(dá) 各組在實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后立即取心尖組織80～100 mg勻漿、離心取上清液－80℃保存，提取蛋白并采用BCA方法檢測蛋白濃度，每組取等量蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，放入含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫振蕩封閉2 h。一抗1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜。取出PVDF膜用磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST液）洗膜15 min×3次。按1∶2 000的比例加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)2 h。PBST液洗膜15 min×3次。利用MGIAS－1000多媒體凝膠成像分析系統(tǒng)測量條帶的積分光密度值。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照進(jìn)行校正，求灰度比值代表特異性條帶的信號(hào)強(qiáng)弱。

1.3.5 心肌組織中NGF mRNA的表達(dá) 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取心尖組織液氮保存。NGF mRNA在心肌的表達(dá)水平測定通過逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）半定量方法測定。液氮凍存的心肌組織剪碎約100 mg加入1 ml Trizol提取心肌組織中總mR?NA。紫外分光光度計(jì)（UV－2550）測量 A260 nm／A280 nm，計(jì)算RNA純度及濃度。取總 RNA 2 μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA 5 μl，加入25 μl反應(yīng)體系。引物：NGF上游引物5＇－CCGAGCCCCGAATCCTGTA GAGAG－3＇NGF下游引物5＇－GGGAAGGGGGCTGCA GGCAAG－3＇擴(kuò)增產(chǎn)物211bp；GAPDH 上游引物 5＇－GGGGGGAGC?CAAAAGGGTCA－3＇GAPDH下游引物5＇－CCCTC?CGACGCCTG CTTCA－3＇擴(kuò)增產(chǎn)物465 bp，所有引物是由上海生物工程公司合成的。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，58℃退火45 s，72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸8 min，取擴(kuò)增產(chǎn)物1 μl加樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，成像分析掃描，以每例標(biāo)本NGF與GAPDH電泳帶灰度值之比作為該例標(biāo)本目的基因表達(dá)的相對(duì)數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測量方差分析，各組間指標(biāo)的比較采用單因素方差分析（Least Signifi?cant Difference，最小顯著差值法）；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血流動(dòng)力學(xué) T0時(shí)各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T1、T2時(shí)I／R組LVSP、HR較S組顯著降低，LVEDP升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組心臟不同時(shí)點(diǎn)LVSP、LVEDP、HR的變化（n＝8，±s）

表1 各組心臟不同時(shí)點(diǎn)LVSP、LVEDP、HR的變化（n＝8，±s）

注：與T0比較?P＜0.05；與S組比較＃P＜0.05。

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2.2 心肌酶學(xué)指標(biāo) 與S組相比、I組和I／R組血清CKMB、LDH濃度顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組實(shí)驗(yàn)處理末血清CKMB和LDH濃度（n＝8，±s）

表2 各組實(shí)驗(yàn)處理末血清CKMB和LDH濃度（n＝8，±s）

注：與S組比較?P＜0.05；與I組比較＃P＜0.05。

組別 CKMB（IU／L） LDH（IU／L）S組 145±34 436±77 I組 1 709±274?1 405±233?I／R組 2 076±476?＃2 918±464?＃

2.3 不同區(qū)域心肌NGF蛋白表達(dá) 免疫組化分析顯示，I／R組大鼠心肌組織IS區(qū)和NIS區(qū)均有NGF蛋白免疫組化陽性表達(dá)。IS區(qū)NGF表達(dá)水平顯著高于NIS區(qū)（P＜0.01）。見圖1。

圖1 I／R組大鼠IS區(qū)和NIS區(qū)心肌細(xì)胞NGF蛋白表達(dá)（SABC法免疫組化×400，DAB顯色，標(biāo)尺100 μm）

2.4 各組NGF蛋白表達(dá)量（Western－blot法） 與S組比較，I組、I／R組心肌組織NGF蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），I／R組心肌組織NGF蛋白表達(dá)高于I組（P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 各組心肌組織內(nèi)NGF蛋白表達(dá)（n＝8）

2.5 各組心肌組織中NGF mRNA表達(dá)（RT－PCR法） 各組大鼠心肌組織中均有NGF mRNA表達(dá)，S組心肌組織表達(dá)NGF mRNA最低。與S組比較，I組、I／R組心肌組織NGF mRNA表達(dá)增加（P＜0.05），I／R組高于I組（P＜0.05）。詳見圖3。

圖3 各組心肌組織內(nèi)NGF mRNA含量（n＝8）

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過阻斷LAD建立在體大鼠I／R模型。結(jié)果表明，心臟缺血再灌注過程中內(nèi)源性NGF表達(dá)增加，在缺血區(qū)心肌該表達(dá)尤其明顯。本研究還表明，在缺血末期和再灌注末期NGF的表達(dá)均有所增加，再灌注末期NGF的表達(dá)明顯高于缺血末期，提示NGF的高表達(dá)在缺血刺激后即開始啟動(dòng)，并持續(xù)至再灌注過程中。

NGF長期以來一般被認(rèn)為僅作用于神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)元的分化、發(fā)育以及維持生理功能等具有重要作用。近年來，其顯著的心血管效應(yīng)引起了心血管科學(xué)家們的興趣。NGF是心臟形成、血管發(fā)生和發(fā)育的重要調(diào)控因素之一，可影響內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞的存活。既往，零星研究提示NGF對(duì)抗心肌缺血（／再灌注）損傷的效應(yīng)可能是通過其對(duì)心臟交感神經(jīng)、感覺神經(jīng)等的功能保護(hù)而產(chǎn)生的。例如，Abe等在狗的在體冠脈阻斷15 min的心肌缺血模型上，觀測到外源性冠脈內(nèi)給予NGF或刺激神經(jīng)內(nèi)源性釋放NGF均能有效防止心肌缺血后的交感神經(jīng)抑頓，從而改善心臟功能［5］。Hiltunen等也在大鼠在體I／R模型上觀測到NGF mRNA表達(dá)的增加［6］。與既往研究一致，本研究也證實(shí)了內(nèi)源性NGF在心臟I／R過程中的過表達(dá)。而且，這種缺血誘導(dǎo)的NGF過表達(dá)在再灌注過程中仍然持續(xù)存在，并且主要發(fā)生于缺血區(qū)，提示NGF的表達(dá)增加可能是心肌在經(jīng)歷缺血刺激后一種代償性的自身保護(hù)機(jī)制。

新近發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌梗死模型上，局部的NGF基因轉(zhuǎn)移能夠維持心肌細(xì)胞的存活，更不同以往的是，NGF被發(fā)現(xiàn)能減輕離體梗死心肌細(xì)胞凋亡。Caporali等發(fā)現(xiàn)，NGF是心肌細(xì)胞自分泌的一種促存活因子。在表達(dá)NGF和trkA受體（NGF效應(yīng)的心肌細(xì)胞膜受體）的新生大鼠心肌上，用NGF抗體或trkA抑制劑K252a均能夠引起心肌細(xì)胞凋亡。在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞上，以能引起細(xì)胞凋亡的缺氧／復(fù)氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）或血管緊張素Ⅱ（angiotensionⅡ，ANGⅡ）處理后，NGF的表達(dá)明顯增加；而對(duì)這兩種處理的NGF－trkA通路進(jìn)行阻斷后，心肌細(xì)胞的凋亡顯著加劇。而且，在新生和成年大鼠心肌細(xì)胞的H／R或ANG II處理模型上，以基因轉(zhuǎn)移或重組蛋白方式外源性地增高NGF水平能保護(hù)細(xì)胞免受凋亡［7］。上述現(xiàn)象提示了NGF對(duì)病理性損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)可源于其心臟神經(jīng)調(diào)節(jié)以外的直接效應(yīng)。

NGF減輕心肌I／R損傷的機(jī)制，尤其是非神經(jīng)源性的保護(hù)機(jī)制目前仍不清楚。本研究未涉及內(nèi)源性NGF過表達(dá)在I／R過程中對(duì)心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制，而相關(guān)的研究仍然不多。最近的研究在PC12細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，NGF激活的磷脂酰肌醇3－激酶－Akt（PI3K－Akt）信號(hào)通路，可通過增加GRP78的表達(dá)拮抗2－脫氧－d－葡萄糖模擬的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endo?plasmic reticulum stress，ERS）引發(fā)的凋亡［8］。ERS是同樣是心肌I／R過程細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一［9］。因此，NGF的心肌保護(hù)作用是否通過PI3KAkt信號(hào)通路仍有待證實(shí)。

綜上所述，本研究通過在體大鼠I／R心臟表明，心肌缺血可誘發(fā)內(nèi)源性NGF的代償性過表達(dá)，該表達(dá)可持續(xù)至再灌注過程中，并且在缺血區(qū)心肌細(xì)胞中尤其明顯。

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The expression of endogenous nerve growth factor in rat hearts during acute is?chemia reperfusion injury

Wei Ke，Ao Li，Liu Li，Min Su
Department of Anesthesiology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Min Su，Email：ms89011068＠163.com

ObjectiveTo investigate the expression of endogenous nerve growth factor（NGF）in the different part of the is?chemic rat hearts during different stage of ischemia and reperfusion.MethodsTwenty－four healthy male SD rats aged 8－10weeks weighing 200－300 g were randomly assigned to one of the 3 groups（n＝8）：sham group（Group S），ischemia group（Group I）and ischemia－reperfusion group（Group I／R）.Hemodynamics of left ventricular was monitored during the operation.Left anterior descend?ing coronary artery（LAD）of the rat hearts were separated without clamping in Group S.LAD was clamped for 30 min without unclamping in Group I.The hearts were undergoing 30 min of ischemia and 120 min of reperfusion by clamping and unclamping of the LAD in Group I／R.Blood samples were collected from arterial carotis communis at the end of the operation for determination of creatine kinase－MB（CKMB）and lactate dehydrogenase（LDH）activity.The animals were then sacrificed and myocardial specimens were ob?tained from the left and right ventricular for NGF expression assay by immune－h(huán)istochemistry.Myocardia from the tip of the hearts were collected for the determination of the expression of NGF and NGF mRNA in each group by Western－blot and RT－PCR.ResultsA dramatic decrease of cardiac function at the end of ischemia and reperfusion was observed in Group I and Group I／R，CKMB and LDH were also significantly decreased（P＜0.05）.Eexpressions of NGF and NGF mRNA in the Group I and Group I／R were both in?creased，and Group I／R was with a significant higher level（P＜0.05）.In the hearts undergoing ischemia and reperfusion，NGF ex?pression in the ischemic area was higher than that in the none－ischemic area within the same heart（P＜0.05）.ConclusionMyocar?dial ischemia may trigger the increasing expression of endogenous NGF and continue to the reperfusion stage，this overexpression of NGF is more obvious in ischemic area of the heart.

Nerve growth factor；Reperfusion injury；Myocardium；Rat心臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion inju?ry，IRI）仍然是復(fù)灌心肌面臨的主要問題［1］，能否有效防治IRI直接關(guān)系到治療效果和預(yù)后。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)素家族中的一員，長期以來一般被認(rèn)為僅作用于神經(jīng)系統(tǒng)［2］。近年來發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌NGF，

2013?09?12）

2013?09?30）

10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2014.01.14基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目（81000066）作者單位：400016重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科通訊作者：閔 蘇，Email：ms89011068＠163.com

健康清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，鼠齡8～10周，體重200～300 g，隨機(jī)分為3組（n＝8）：假手術(shù)組（S組）、單純?nèi)毖M（I組）和缺血再灌注組（I／R組），術(shù)中監(jiān)測左心血流動(dòng)力學(xué)。S組左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）僅穿線，不結(jié)扎，持續(xù)觀察150 min后抽血取心肌標(biāo)本；I組結(jié)扎LAD 30 min；I／R組結(jié)扎LAD 30 min后，復(fù)灌120 min制備心臟缺血再灌注損傷模型。各組實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后在頸總動(dòng)脈處采血測定血清肌酸激酶（CKMB）和乳酸脫氫酶（LDH）的濃度，然后處死大鼠。I／R組分別取左室和右室心肌組織用免疫組化法觀察NGF的表達(dá)。各組取心尖組織心肌Western－bloting測定NGF的表達(dá)；RT－PCR檢測各組NGF mRNA的表達(dá)。結(jié)果與S組相比，I組和I／R組在缺血和再灌注末期左心功能明顯降低，血清LDH、CKMB濃度升高，心肌組織中NGF mRNA和NGF蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），I／R組高于I組；在經(jīng)歷I／R的心臟中，缺血區(qū)NGF表達(dá)高于非缺血區(qū)（P＜0.05）。結(jié)論心肌缺血能誘發(fā)內(nèi)源性NGF的表達(dá)增加并持續(xù)至再灌注過程，這種NGF的高表達(dá)在缺血區(qū)心肌中尤其明顯。