馬新華 邵文俊 金宛宛 高 宇

·論著·

尋常痤瘡皮損炎癥程度與外周血Th17細(xì)胞和IL－17的關(guān)系

馬新華 邵文俊 金宛宛 高 宇?

目的: 確定尋常痤瘡皮損炎癥程度與外周血Th17細(xì)胞和IL－17的相關(guān)性。方法: 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th17細(xì)胞水平,酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞IL－17A mRNA的表達(dá),RT－PCR法檢測(cè)IL－17A mRNA水平。結(jié)果: 正常對(duì)照組、輕度痤瘡組3項(xiàng)指標(biāo)顯著低于中重度痤瘡組(P＜0.05),健康對(duì)照組和輕度痤瘡組之間無(wú)顯著差別(P＞0.05)。結(jié)論: Th17細(xì)胞可能和中重度痤瘡的發(fā)病和炎癥性皮損的形成有關(guān),有望通過(guò)抑制Th17細(xì)胞的作用來(lái)治療中重度痤瘡。

痤瘡； Th17細(xì)胞； 白介素17； IL－17A mRNA

Th17細(xì)胞是一類(lèi)新近發(fā)現(xiàn)的CD4＋T細(xì)胞,研究發(fā)現(xiàn),Th17細(xì)胞在防御細(xì)菌感染、介導(dǎo)慢性炎癥以及自身免疫病中發(fā)揮重要作用。1尋常痤瘡表現(xiàn)為面部丘疹、膿皰、囊腫性皮疹,特別是中重度痤瘡,臨床炎癥性皮疹更多,嚴(yán)重程度更重,Th17細(xì)胞在中重度痤瘡的病理機(jī)制中可能有比較重要的意義。通過(guò)檢測(cè)尋常痤瘡患者外周血Th17細(xì)胞效應(yīng)因子、數(shù)量以及外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)IL－17A mRNA水平,以確定Th17細(xì)胞與尋常痤瘡發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 根據(jù)Pillsbury法,2將尋常痤瘡患者分為I～I(xiàn)V度,輕度痤瘡(即I度)組,中重度痤瘡(即II～I(xiàn)V度)組。所有病例為我院門(mén)診患者隨機(jī)選取32例輕度痤瘡患者,35例中重度痤瘡患者,30例健康對(duì)照組為正常體檢者,所入選者2個(gè)月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗生素。本研究中臨床標(biāo)本的采集均經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并同研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑 本研究所用試劑:培養(yǎng)基RPMI 1640由Hyclone公司提供,滅活胎牛血清由晶美生物公司提供,人IL－17 ELISA試劑盒由美國(guó)Rapidbio公司提供,淋巴細(xì)胞分離液由上海華精生物公司提供,人Th17 Flow試劑盒為美國(guó)eBioscience產(chǎn)品,RNA提取試劑由Invitrogen公司提供,M－Mulv Reverse Transcriptase為Promega公司產(chǎn)品,IL－17A mRNA引物設(shè)計(jì)、合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清樣本以及細(xì)胞準(zhǔn)備 抽取研究對(duì)象的外周血3 mL,室溫靜置30 min,以1500 r/min離心15 min,取其上清液,于－20℃保存?zhèn)溆?剩余樣本加PBS液稀釋1倍混勻后加入分離液Ficoll－Hypaque,以1500 r/min離心10 min,用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL,將PBMC接種于24孔培養(yǎng)板置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 IL－17的檢測(cè) 采用人IL－17 ELISA試劑盒,以及多功能微孔板分析儀,檢測(cè)各標(biāo)本IL－17的濃度。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞 按照人Th17 Flow試劑盒操作說(shuō)明書(shū),加入滲透洗脫緩沖液重懸細(xì)胞,分別加入FICT標(biāo)記的人CD4抗體和PE標(biāo)記的人IL－17A抗體,另設(shè)同型陰性對(duì)照,作流式細(xì)胞術(shù)分析,用Thl7細(xì)胞占外周血CD4＋T細(xì)胞的比例來(lái)評(píng)價(jià)Thl7細(xì)胞的水平。

1.3.4 檢測(cè)IL－17A mRNA的表達(dá)水平 采用RTPCR法,上游引物5'－GAAGGCAGGAATCACA－3',下游引物:5'－TCCGAAATGAGGCTGTCTT－3'。所設(shè)計(jì)的上游引物處于IL－17A mRNA的108～123 bp位置,下游引物處IL－17AmRNA的594～612 bp位置,此引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度505 bp。β－actin上游引物:5'－CTTCTACAATGAGCTGCGTGTG－3',下游引物:5'－AGTCATAGTCCGCCTAGAAGCAT－3'。將提取的PBMC,調(diào)整濃度為2×106/L,Trizol一步法提取總RNA,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的A260/A280值以確定RNA的純度和總量。取各組5μL總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系為40μL,擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min,94℃30 s,53℃30 s,72℃40 s共28個(gè)循環(huán),72℃延伸8min。電泳分析:每個(gè)樣品取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物, 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)攝取各樣品電泳圖,并通過(guò)成像分析軟件Quantity One進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)量數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,應(yīng)用單因素方差分析比較中重度痤瘡組、輕度痤瘡組和正常對(duì)照組各組間的差異。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組間Th17細(xì)胞相關(guān)的3項(xiàng)指標(biāo)比較,見(jiàn)表1。

2.2 Th17細(xì)胞占外周血CD4＋細(xì)胞比例流式細(xì)胞儀檢測(cè),見(jiàn)圖1,PMBC的IL－17A mRNA表達(dá)檢測(cè)電泳,見(jiàn)圖2。

表1 3組外周血IL－17水平、Th17細(xì)胞占外周血CD4＋細(xì)胞比例以及PBMC中IL－17A mRNA表達(dá)水平

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組別外周血中IL－17細(xì)胞所占比例

3 討論

尋常痤瘡皮損是一種原發(fā)性炎癥反應(yīng),細(xì)胞因子在痤瘡皮損形成中目前研究較多是IL－8,作為趨化因子,在炎性痤瘡皮損中表達(dá)高于正常皮膚,且與毛囊角化及血管生成成正相關(guān),還與痤瘡進(jìn)展及嚴(yán)重程度有關(guān),阻斷IL－8作用可減少由其產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)及血管生成,有可能控制輕度痤瘡發(fā)展為中重度痤瘡。3同樣,細(xì)胞因子IL－1活性的增加也可促進(jìn)細(xì)胞角化,而在痤瘡中炎癥反應(yīng)的形成以及毛囊口的角化過(guò)程中發(fā)揮作用。4在痤瘡皮損組織修復(fù)過(guò)程中過(guò)度的免疫反應(yīng)是造成瘢痕的重要因素,所以早期抗炎治療將有助于瘢痕傾向患者避免形成瘢痕。5Th17細(xì)胞能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,其中研究最多的是IL－17,IL－17家族包括6個(gè)成員:IL－17A、B、C、D、E和F,通常認(rèn)為IL－17A與皮膚炎癥有關(guān)聯(lián)。有研究者發(fā)現(xiàn),在接種結(jié)核分枝桿菌疫苗后,IL－17可促進(jìn)局部肺組織建立保護(hù)性CD4＋T細(xì)胞免疫應(yīng)答。6除了具有促炎癥因子的特性,IL－17還可激活中性粒細(xì)胞促其遷移募集到炎癥部位發(fā)揮免疫損傷作用。7IL－17也能夠抑制白色念珠菌和曲霉菌感染。8IL－17也能介導(dǎo)炎癥,影響感染、腫瘤和免疫的病理過(guò)程。9諸多的研究證明,Th17是慢性炎癥微環(huán)境中重要的效應(yīng)細(xì)胞,在病原體等誘導(dǎo)的慢性炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

尋常痤瘡是一種累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病,Pillsbury分級(jí)法將尋常痤瘡進(jìn)行分級(jí),以表現(xiàn)為黑頭粉刺及散在的炎性丘疹分為輕度,輕度痤瘡病理表現(xiàn)為毛囊漏斗內(nèi)的角化細(xì)胞潴留及毛囊漏斗部囊狀擴(kuò)張,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少。而中重度痤瘡表現(xiàn)為炎性的丘疹、膿皰,以及結(jié)節(jié)和囊腫,其病理表現(xiàn)為毛囊漏斗上皮的破裂,中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、異物巨細(xì)胞聚集,明顯的炎癥臨床及病理表現(xiàn)。

圖2 RT－PCR檢測(cè)各組外周血單個(gè)核細(xì)胞IL－17A mRNA表達(dá)

我們發(fā)現(xiàn)中重度痤瘡患者Th17細(xì)胞及其效應(yīng)因子、IL－17A mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組以及輕度痤瘡患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而輕度痤瘡患者與正常對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。這些結(jié)果提示:有可能Th17細(xì)胞在形成中重度痤瘡炎癥性的皮疹中發(fā)揮重要作用,特別是對(duì)于炎癥強(qiáng)烈的膿腫、囊腫的形成可能有重要的意義,這也進(jìn)一步證實(shí)了Th17細(xì)胞促進(jìn)炎性反應(yīng)、募集中性粒細(xì)胞的作用。而中重度痤瘡患者外周血中Th17細(xì)胞活性增強(qiáng)的機(jī)制,目前未明,有待進(jìn)一步研究。

Th17細(xì)胞有可能成為治療中重度痤瘡新的靶點(diǎn),即通過(guò)阻斷Th17細(xì)胞的作用,來(lái)阻斷尋常痤瘡的炎癥加重,促進(jìn)炎癥的恢復(fù)。

1 Bettelli E,Korn T,Kuchroo VK.Th17:the third member of the effector T cell trilogy.Curr Opin Immunol,2007,19:652－657.

2張學(xué)軍.皮膚性病學(xué).8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013.175－177.

3Abd EAHS,Shoukry NS,El MRA,et al.Immunohistochemical expression of interleukin 8 in skin biopsies from patientswith inflammatory acne vulgaris.Diagn Pathol,2007,2:4.

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(收稿:2013－08－22 修回:2013－11－03)

The relationship between the severity of the lesion and Th17 cells and IL－17 level in the peripheral blood of patientswith acne vulgaris

MAXin-hua,SHAOWen-jun,JINWan-wan,et al.Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To correlate the severity of the lesion and the level of Th17 cells,and the expression of IL－17 among the patientswith acne vulgaris.Methods:The Th17 cells in the peripheral blood were evaluated by flow cytometry.The IL－17 level in the peripheral blood wasmeasured by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA).The level of IL－17A mRNA was detected by RT－PCR.Results:The level of the three parametersmentioned above was lower in healthy controls and the patientswithmild degree of acne vulgaris than in the patientswithmid－and severe acne vulgaris(P＜0.05).Therewas no significant difference in the three parameters between the healthy controls and the patients with mild acne vulgaris(P＞0.05).Conclusion:Th17 cellsmay be involved in the developmentofmid－and severe acne vulgaris and the formation of inflammatory lesions.

acne；Thl7 cells；IL－17；IL－17A mRNA

浙江省溫州市科技局課題(編號(hào):Y20120173)

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科,溫州,325027

?通信作者