李春霞 魏紅軍 郜玉玲 史同新 李 民 曲才杰

Livin和Smac在鮑恩病及皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)

李春霞 魏紅軍 郜玉玲 史同新 李 民 曲才杰?

目的: 確定Livin和Smac在鮑恩病(BD)及皮膚鱗狀細(xì)胞癌(SCC)中的表達(dá)和意義。方法:應(yīng)用免疫組化SP法檢測35例BD和32例SCC中Livin和Smac的表達(dá),分析二者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果: Livin表達(dá):BD組高于BD癌旁組織(P＜0.001)；BD癌旁組織高于正常對照組(P＜0.05)。SCC組高于SCC癌旁組織(P＜0.001)；SCC癌旁組織高于正常對照組(P＜0.05)。SCC組高于BD組(P＜0.05)。Smac表達(dá):BD組低于BD癌旁組織(P＜0.01)；BD癌旁組織低于正常對照組(P＜0.05)；SCC組低于SCC癌旁組織(P＜0.001)；SCC癌旁組織低于正常對照組(P＜0.05)；SCC組低于BD組(P＜0.05)。Livin和Smac在BD中表達(dá)無相關(guān)性(P＞0.05),在SCC中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論: Livin的過表達(dá)和Smac的低表達(dá)可能在BD和SCC的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用。

鮑恩??； 癌； 鱗狀細(xì)胞； Livin； Smac

鮑恩病(Bowen's disease,BD)和皮膚鱗狀細(xì)胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC)是常見的皮膚惡性腫瘤,其中BD屬于原位鱗狀細(xì)胞癌,少數(shù)可發(fā)展為侵襲性鱗狀細(xì)胞癌。細(xì)胞凋亡調(diào)控異常在腫瘤形成過程中起十分重要的作用。Livin是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)新成員,在大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),抑制細(xì)胞的凋亡。Smac為第二個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑,通過去除IAPs對半胱氨酸蛋白酶的抑制作用,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。本研究利用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析Livin和Smac在BD、皮膚SCC以及癌旁組織中的表達(dá),以探討Livin和Smac在BD和皮膚SCC的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用。

1 對象與方法

1.1 對象和試劑 32例SCC和35例BD標(biāo)本均來自青島市市立醫(yī)院皮膚科2007年1月至2012年6月資料保存完整的病例。其中男37例,女30例,男:女為1.23∶1,年齡41～90歲,平均72.4±13.0歲,病程1個月～10年,平均1.7±1.2年。所有病例均無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。35例BD中皮損單發(fā)33例,其中發(fā)生于頭面部6例,軀干12例,四肢13例,手背1例,甲床1例。多發(fā)2例,其中1例累及軀干和四肢,1例累及頭皮、軀干和四肢。32例SCC均為單發(fā),其中發(fā)生于頭面部8例,軀干8例,四肢7例,口唇3例,女陰3例,陰莖2例,肛周1例。32例SCC按Broder分級標(biāo)準(zhǔn)1均為I級。對照組30例為皮膚外科美容手術(shù)中修剪遺棄的正常皮膚。

兔抗人Livin多克隆抗體,工作濃度1∶200,兔抗人Smac多克隆抗體,工作濃度1∶100,均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。通用型免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購于福建邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法 Livin和Smac的檢測均采用免疫組化SP法,實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,用已知染色陽性的組織切片為陽性對照,用PBS代替一抗為陰性對照。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):Livin陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒,Smac陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。參考文獻(xiàn)2的半定量計數(shù)方法,根據(jù)腫瘤細(xì)胞的染色率和染色強(qiáng)度進(jìn)行判定。在400倍鏡下隨機(jī)選取10個視野,每個視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞,觀察細(xì)胞的染色強(qiáng)度,計算陽性細(xì)胞百分率。腫瘤細(xì)胞陽性率＜5%為0分,5%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,＞75%為4分；根據(jù)染色強(qiáng)度分為4級,無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。每個視野陽性細(xì)胞百分率與染色強(qiáng)度得分相乘為該視野得分,最終得分為5個視野得分的平均值。0～4分為陰性,5～8分為陽性,9～12分為強(qiáng)陽性。以陽性例數(shù)和強(qiáng)陽性例數(shù)合并計算陽性率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗及Spearman相關(guān)分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Livin和Smac的表達(dá) Livin在BD和SCC的表達(dá)見表1。Livin在BD中表達(dá)強(qiáng)陽性14例(圖1),陽性12例(圖2),陽性率為74.29%；在BD癌旁組織和正常對照組陽性率分別為22.88%和3.33%。Livin在BD中表達(dá)率高于BD癌旁組織(χ2＝18.529,P＜0.001)和正常對照組(χ2＝33.488,P＜0.001)；在BD癌旁組織表達(dá)率高于正常對照組(χ2＝5.162,P＜0.05)。Livin在SCC中表達(dá)強(qiáng)陽性21例(圖3),陽性9例(圖4),陽性率為93.75%；在SCC癌旁組織陽性率為25.00%。Livin在SCC中表達(dá)率高于癌旁組織(χ2＝31.352,P＜0.001)和正常對照組(χ2＝50.633,P＜0.001)；在SCC癌旁組織表達(dá)率高于正常對照組(χ2＝5.858,P＜0.05)。Livin在SCC中的表達(dá)率高于BD (χ2＝4.615,P＜0.05)。

Smac在SCC和BD的表達(dá)情況見表1。Smac在BD中表達(dá)強(qiáng)陽性8例,陽性10例,陰性17例(圖5),陽性率為51.43%；在BD癌旁組織和正常對照組陽性率分別為82.86%和100.00%。Smac在BD中表達(dá)率低于癌旁組織(χ2＝7.835,P＜0.01)和正常對照組(χ2＝19.732,P＜0.001)；在BD癌旁組織表達(dá)率低于正常對照組(χ2＝5.666,P＜0.05)。Smac在SCC中表達(dá)強(qiáng)陽性1例,陽性7例,陰性24例(圖6),陽性率為25%；在SCC癌旁組織陽性率為84.38%。Smac在SCC中表達(dá)率低于癌旁組織(χ2＝22.763,P＜0.001)和正常對照組(χ2＝36.711,P＜0.001)；在SCC癌旁組織表達(dá)率低于正常對照組(χ2＝5.099,P＜0.05)。Smac在SCC中的表達(dá)率低于BD(χ2＝4.917,P＜0.05)。

2.2 Livin和Smac在BD和SCC中表達(dá)的相關(guān)性見表2、3。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析。Livin和Smac在BD中表達(dá)無相關(guān)性(r＝－0.210,P＞0.05)；Livin和Smac在SCC中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r＝－0.415,P＜0.05)。

表1 Livin和Smac在BD和SCC中的表達(dá)

圖1 Livin在BD中強(qiáng)陽性表達(dá)(箭頭),細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核呈棕褐色(SP法,×100)圖2 Livin在BD中陽性表達(dá)(箭頭),細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核呈淡褐色(SP法,×100)圖3 Livin在SCC中強(qiáng)陽性表達(dá)(箭頭),細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核呈棕褐色(SP法,×100)圖4 Livin在SCC中陽性表達(dá)(箭頭),細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核呈淡褐色(SP法,×100)圖5 Smac在BD中陰性表達(dá)(箭頭),細(xì)胞質(zhì)無著色(SP法,×100)圖6 Smac在SCC中陰性表達(dá)(箭頭),細(xì)胞質(zhì)無著色(SP法,×100)

表2 Livin和Smac在BD中表達(dá)的相關(guān)性

表3 Livin和Smac在SCC中表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

Livin是凋亡抑制蛋白家族的新成員,其N端含有一個高度保守的長約70個氨基酸的桿狀病毒IAPs重復(fù)序列(baculovirus IAP repeats,BIR),Livin通過其BIR區(qū)與Caspase結(jié)合,抑制Caspase的活性,從而抑制細(xì)胞的凋亡。Livin在正常人的大多數(shù)終末組織中(胎盤除外)低表達(dá)或不表達(dá),在大多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)。3－5少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)Livin在皮膚SCC中的表達(dá)高于正常表皮,認(rèn)為Livin蛋白的異常表達(dá)可能與SCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。12,13我們的研究顯示Livin在 SCC中的表達(dá)高于正常表皮,文獻(xiàn)報道相似。關(guān)于Livin在BD中的表達(dá)尚未見報道,本研究顯示Livin在BD中的表達(dá)高于正常表皮,但低于SCC,提示Livin蛋白的異常表達(dá)可能與BD的發(fā)生有關(guān),也可能在BD發(fā)展為侵襲性SCC過程中起一定作用。

Smac為第二個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑(second mitochondria－derived activator of caspase),Smac在正常成人的睪丸表達(dá)水平最高,在心臟、肝臟、腎臟等也有較高表達(dá),在腦、肺、胸腺及外周血中為低表達(dá)。Smac在正常細(xì)胞中不誘發(fā)凋亡,在受損細(xì)胞中,Smac通過與IAPs的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合,解除IAPs對Caspase的抑制,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Yoo等6研究了Smac在不同腫瘤中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:Smac在癌癥中的表達(dá)率為62%,其中胃癌42/60,結(jié)腸癌7/10,肺癌4/10,卵巢癌7/10,前列腺癌2/10；在肉瘤中表達(dá)率為22%,其中惡性神經(jīng)鞘病2/8,橫紋肌肉瘤5/11,皮膚纖維肉瘤2/7,平滑肌肉瘤1/6,尤文肉瘤1/2,8例血管肉瘤和8例脂肪肉瘤中均無表達(dá)。表明Smac在不同腫瘤中的表達(dá)不同。一些研究發(fā)現(xiàn)Smac在肝癌、胰腺癌、胃癌、口腔鱗癌、皮膚鱗癌組織中的表達(dá)低于正常,7－9,11,12在非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤組織中的表達(dá)高于正常。5,10我們的研究顯示Smac在皮膚SCC中的表達(dá)低于正常表皮,提示Smac低表達(dá)可能在皮膚SCC的發(fā)病中起一定作用。Smac在BD中表達(dá)情況目前尚無報道,本研究顯示Smac在BD中的表達(dá)低于正常表皮,但高于皮膚SCC,提示Smac蛋白的異常表達(dá)可能與BD的發(fā)生有關(guān),也可能在BD發(fā)展為侵襲性SCC過程中起一定作用。

癌旁組織是指鄰近腫瘤病灶,組織學(xué)無惡變特征的組織。本研究顯示Livin在BD和SCC的癌旁組織中的表達(dá)低于BD和SCC,但均高于正常對照組,而Smac在BD和SCC的癌旁組織中的表達(dá)高于BD和SCC,但均低于正常對照組,提示癌旁組織雖然組織學(xué)表現(xiàn)正常,但其凋亡調(diào)控已經(jīng)出現(xiàn)異常,具有惡變傾向。

Livin和Smac在不同腫瘤中表達(dá)的相關(guān)性報道不一,一些研究顯示Livin和Smac在非小細(xì)胞肺癌和骨肉瘤中均為高表達(dá),二者表達(dá)呈正相關(guān)。5,10另外一些研究顯示Livin蛋白在肝癌、胰腺癌和胃癌組織中表達(dá)高于正常,而Smac蛋白在肝癌、胰腺癌和胃癌組織中表達(dá)低于正常,二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān),從而認(rèn)為Livin可能在某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要促進(jìn)作用,而Smac在預(yù)防某些腫瘤的的發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用。7－9

本研究顯示Livin在BD和SCC中高表達(dá),Smac在BD和SCC中低表達(dá),二者在BD中表達(dá)的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義,在皮膚SCC中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),Livin高表達(dá)和Smac低表達(dá)可能共同參與了BD和皮膚SCC的發(fā)生、發(fā)展。Livin通過與Caspase結(jié)合發(fā)揮其抗凋亡作用,Smac通過與Livin結(jié)合抑制Livin的抗凋亡作用,發(fā)揮其促凋亡作用。Livin的RNG結(jié)構(gòu)具有E3(泛素連接酶)活性,Smac與Livin結(jié)合后,Livin通過泛素－蛋白酶體途徑促進(jìn)Smac降解?？傊?抗凋亡蛋白Livin和促凋亡蛋白Smac之間存在著相互拮抗,相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。二者表達(dá)失調(diào)可能共同參與了BD和皮膚SCC的發(fā)生、發(fā)展。

1趙辨.臨床皮膚病學(xué).3版.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2001. 1527－1529.

2 FalleniM,Pelleqrini C,Marchetti A,et al.Survivin gene expression in early－stage non－small cell lung cancer.J Pathol, 2003,200(5):620－626.

3 Lin JH,Deng G,Huang Q,et a1.KIA:a novelmember of the inhibitor of apoptosis protein family.Biochem Biophys Res Commun,2000,279(3):820－831.

4Gazzaniga A,Gradilone P,Giuliani L,et al.Expression and prognostic significance of Livin,Survivin and other apoptosis－related genes in the progression of superficial bladder cancer.Ann Oncol,2003,14(1):85－90.

5陳曉,楊春鹿,趙君,等.非小細(xì)胞肺癌組織Livin和Smac蛋白表達(dá)及其臨床意義的研究.中華腫瘤防治雜志,2008,15 (12):905－909.

6 Yoo NJ,Kim HS,Kim SY,et al.Immunohistochemical analysis of Smac/DIABLO expression in human carcinomas and sarcomas.APMIS,2003,111(3):382－388.

7李長新,馮震博.Livin、Smac在肝癌中的表達(dá)及與凋亡、增殖的關(guān)系.臨床肝膽病雜志,2010,26(5):536－539.

8趙永福,呂以東,劉洪峰,等.Livin和Smac蛋白在胰腺癌中的表達(dá)及其意義.中華胰腺病雜志,2011,11(4):275－277.

9陳繼紅,魏少忠,陳健,等.人胃癌組織中Smac和Livin的表達(dá)及其臨床意義.中華實驗外科雜志,2008,25(7):886－887.

10高大新,劉志新,劉飛,等.凋亡相關(guān)因子Smac、Livin與Caspase－3在骨腫瘤中表達(dá)及其意義.中華實驗外科雜志, 2009,26(11):1533－1534.

11陳冰,孫雷,王波,等.FHIT、Livin、Smac在口腔鱗癌中的表達(dá)及意義.口腔醫(yī)學(xué)研究,2008,24(2):192－194.

12丁瑜潔,陳曉棟,顧黎雄,等.角化棘皮瘤和皮膚鱗狀細(xì)胞癌凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的研究.中華皮膚科雜志,2012,45(2): 91－94.

13陶菲克,涂亞庭.Livin和Caspase－3在皮膚基底細(xì)胞癌和皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及相關(guān)性分析.中國皮膚性病學(xué)雜志,2009,23(2):88－94.

(收稿:2013－09－08 修回:2013－10－15)

The expression and significance of Livin and Smac protein in Bowen's disease and skin squamous cell carcinoma

LIChun-xia,WEIHong-jun,GAO Yu-ling,et al.Department of Dermatology,Qingdao Municipal Hospital, Qingdao,266011

Objective:To investigate the expression and significance of Livin and Smac protein in Bowen's disease(BD)and skin squamous cell carcinoma(SCC).Methods:Immmunohistochemical SP method was used to detect the expression of Livin and Smac in 35 cases of BD and 32 cases of SCC.The relationship between the expressions of BD and Smac was analyzed.Results:The expression of Livin was higher in BD group than in adjacent tissue of BD(P＜0.001)and higher in adjacent tissue of BD than in control group(P＜0.05). The expression of Livin was higher in SCC group than in adjacent tissue of SCC(P＜0.001)and was higher in adjacent tissue of SCC than in control group(P＜0.05).The expression of Livin was higher in SCC group than in BD group(P＜0.05).The expression of Smac was lower in BD group than in adjacent tissue of BD(P＜0.001)and lower in adjacent tissue of BD than in control group(P＜0.05).The expression of Smac was lower in SCC group than in adjacent tissue of SCC(P＜0.001)and was lower in adjacent tissue of SCC than in control group(P＜0.05).The expression of Smac was lower in SCC group than in BD group(P＜0.05).There was no relationship between the expression of Livin and Smac in BD(P＞0.05).There was a negative relationship between the expression of Livin and Smac in SCC(P＜0.05).Conclusion:The over－expression of Livin and low expression of Smacmay be involved in the occurrence and development of BD and SCC.

Bowen's disease；carcinoma；squamous cell；Livin；Smac

青島市市立醫(yī)院,山東青島,266011

?通信作者