李敏超，李 娜，尤列·皮爾曼，維克多·科羅索夫，周向東*

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸內科，重慶400010;2.俄羅斯醫(yī)學科學院遠東呼吸生理與病理研究中心，俄羅斯布拉戈維申斯克675000)

冷空氣刺激是慢性氣道炎性疾病，如慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和哮喘等疾病的重要急性加重因素［1］。此類患者常在輕微受涼或氣候稍變化時表現(xiàn)急發(fā)加重，而后續(xù)細菌感染、炎性因子浸潤及黏液分泌等事件使疾病呈現(xiàn)更復雜的病理改變［2-3］。從某種意義上講，冷空氣刺激對于此類疾病的觸發(fā)或急性加重在一定程度上起著“扳機點”的作用［1］，故深入探究冷刺激作用于氣道的受體機制及相關信號通路，對于此類疾病的防治有極重要的臨床意義。瞬時受體電位蛋白-8(transient receptor potential protein-8，TRPM8)作為一種特異的冷刺激感應受體，是研究外周溫度感受器對冷刺激反應的最佳候選靶目標［4-5］，本實驗檢測COPD 患者支氣管黏膜上皮內是否有TRPM8 蛋白的高表達及人氣道上皮細胞TRPM8 受體的基本特性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

兔抗TRPM8(C-term)多克隆抗體、非免疫源性正常兔IgG(Abgent 公司);兔SP Kit (SP9001)、DAB Kit (ZLI9018)(北京中杉金橋生物技術有限公司);小鼠抗β-actin 單克隆抗體、HRP 標記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物有限公司);PrimeScript RT reagent Kit 試劑盒、SYBR Premix EX TaqTM、DL2000 marker 和TriZol 試劑盒(TaKaRa Biotechnology 公司);TRPM8 引物(上海生工)。TRPM8通道特異性阻斷劑BCTC、TRPM8shRNA 和對照shRNA(美國鹽湖城猶他大學Christopher A.Reilly教授惠贈);正常人氣道上皮16HBE 細胞(美國標準培養(yǎng)收集所ATCC);RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone 公司);Fluo3-AM(北京碧云天生物技術研究所);脂質體2000(Invitrogen 公司)。

1.2 組織標本

收集因周圍型肺癌于2008年10月至2010年10月在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸外科行肺葉切除術患者的肺組織標本17 例(男13 例，女4例)，取材部位距離腫塊4 cm 以上的上葉段支氣管開口處黏膜組織，所取組織經(jīng)HE 染色證實無癌性病變。所有患者均被告知研究項目內容并簽字知情同意書。術前均未經(jīng)放療及化療，均至少3月未曾使用氨茶堿、β 受體激動劑、激素及抗膽堿能受體藥物。根據(jù)中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺病學組2007年制定的COPD 診斷標準分為COPD(輕至中度)組和對照組(無其他慢性氣道炎性疾病)。COPD 組8 例，男6 例，女2 例，平均年齡58.1 ±6.3 歲(48～65 歲)，5 例為吸煙患者，吸煙量為44.8 ±10.5 包/年;對照組9 例，男7例，女2 例，平均年齡(61.1 ± 8.3)歲(52～72歲)，5 例為吸煙患者，吸煙量為(46.0 ±9.4)包/年。COPD 和對照組病例的年齡、性別、吸煙者所占比例及吸煙量均無明顯差異。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化SP 法檢測TRPM8 的表達:按參考文獻［6］操作(兔抗TRPM8 多克隆抗體為1∶25 稀釋，陰性對照則加入非免疫源性正常兔IgG)。

1.3.2 Real-time PCR 法檢測支氣管黏膜上皮TRPM8 mRNA 表達:按參考文獻［7］操作。TRPM8(AF015521)的上游引物為5'-CAGCGCTGGAGGTG GATATTC-3'，下游引物為5'-CACACACAGTGGCTT GGACTC-3';GAPDH(NM_002046)的上游引物為5'-TGTTCGTCATGGGTGTGAACC-3'，下游引物為5'-C ATGAGTCCTTCCACGATACC-3'。

1.3.3 Western blot 法檢測支氣管黏膜上皮中TRPM8 蛋白表達:按參考文獻［7］操作。兔抗TRPM8多克隆抗體濃度為1∶100，HRP 標記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG 濃度稀釋為1∶2 000。

1.3.4 細胞培養(yǎng)、分組和處理:16HBE 細胞接種于6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，當細胞匯合達70%～80%時隨機分為對照組:細胞于無胎牛血清、無雙抗中37 ℃培養(yǎng);冷刺激組:細胞于無血清培養(yǎng)液、18 ℃培養(yǎng);冷刺激+BCTC 組:細胞于無血清培養(yǎng)液、終濃度BCTC 15 μmol/L 中18 ℃培養(yǎng);冷刺激+TRPM8 shRNA 組:待細胞匯合至90%左右按照脂質體2000 說明書轉染TRPM8 shRNA，轉染后鑒定是否成功及轉染效率，再于無血清培養(yǎng)液中18 ℃培養(yǎng);冷刺激+對照shRNA 組:待細胞匯合至90%左右轉染對照shRNA(操作同上)，再于無血清培養(yǎng)液中18 ℃培養(yǎng)。

1.3.5 MTT 法檢測各組細胞活力:按參考文獻［8］操作。

1.3.6 激光共聚焦測量不同條件下胞內［Ca2+］:濃度:按參考文獻［8］操作，并記錄細胞內6min 時［Ca2+］:濃度變化。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件包分析，結果以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩兩比較采用LSD 檢驗，非齊性資料用秩和檢驗;以黃色區(qū)域作為AOI，用Imagepro-plus 6.0 軟件進行圖像分析。

2 結果

2.1 TRPM8 蛋白在支氣管黏膜上皮內的表達

TRPM8 陽性染色細胞位于支氣管黏膜上皮內，TRPM8 蛋白主要分布于支氣管黏膜上皮基底細胞或小顆粒細胞的細胞膜，部分分布于柱狀上皮細胞或杯狀細胞的胞質(尤其是靠近管腔一側)及細胞膜(圖1A、1B)。陰性對照組無陽性顯色(圖1C)。COPD 組的支氣管黏膜上皮IA/area 值顯著高于對照組(P＜0.05)(表1)。

圖1 COPD 組與對照組氣道上皮TRPM8 蛋白表達水平的比較Fig 1 The comparison of TRPM8 protein expression in bronchial epithelium from control and COPD group(×400)

2.2 TRPM8 mRNA 及TRPM8 protein 的表達

COPD 組支氣管黏膜內TRPM8 mRNA 及TRPM8蛋白相對表達量顯著高于對照組(P＜0.01)(表1)。

表1 COPD 組及對照組支氣管黏膜上皮TRPM8 的表達Table 1 TRPM8 expression in human bronchial epithelium of subjects with COPD and control group (±s，n=17)

表1 COPD 組及對照組支氣管黏膜上皮TRPM8 的表達Table 1 TRPM8 expression in human bronchial epithelium of subjects with COPD and control group (±s，n=17)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control.

group(n)TRPM8 protein immunohistochemistry Western blot TRPM8 mRNA control(9)0.19 ±0.040.67 ±0.081.00 ±0.00 COPD(8)0.24 ±0.05*0.75 ±0.06*3.13 ±0.39＊＊

2.3 細胞活力測定結果

各組細胞在同一時間點吸光度值差異無明顯統(tǒng)計學意義(表2)。

2.4 冷刺激、BCTC 和TRPM8shRNA 轉染對16HBE 胞內［Ca2+］:濃度影響

冷刺激6min 時［Ca2+］:濃度較對照組明顯升高(P＜0.05)。冷刺激+ BCTC 組及冷刺激+TRPM8 shRNA 組均較冷刺激組明顯下降(P＜0.05)。轉染shRNA 對照組值對冷刺激引起的［Ca2+］:濃度無明顯抑制作用(表3)。

表2 各組細胞在不同時間點增殖活力的比較Table 2 The comparison of each cell proliferation activity at different time points(±s，A value，n=5)

表2 各組細胞在不同時間點增殖活力的比較Table 2 The comparison of each cell proliferation activity at different time points(±s，A value，n=5)

group8 hours16 hours24 hours36 hours 37 ℃0.23 ±0.040.37 ±0.030.52 ±0.030.71 ±0.05 18 ℃0.20 ±0.030.37 ±0.030.52 ±0.040.68 ±0.05 18 ℃+BCTC 15μm0.19 ±0.040.35 ±0.030.48 ±0.040.71 ±0.05 18 ℃+TRPM8 shRNA0.19 ±0.040.34 ±0.040.49 ±0.040.66 ±0.06 18 ℃+scramble shRNA0.02 ±0.030.34 ±0.020.50±0.030.68 ±0.05

表3 BCTC 及TRPM8 shRNA 對18 ℃刺激細胞6 min 時胞內［Ca2+］:的抑制作用Table 2 The effect of BCTC and TRPM8 shRNA on［Ca2+］i after exposure to 18 ℃for 6 min(±s，n=5)

表3 BCTC 及TRPM8 shRNA 對18 ℃刺激細胞6 min 時胞內［Ca2+］:的抑制作用Table 2 The effect of BCTC and TRPM8 shRNA on［Ca2+］i after exposure to 18 ℃for 6 min(±s，n=5)

#P＜0.05 compared with 37 ℃group;*P＜0.05 compared with 18 ℃group.

groupfluorescence intensity 37 ℃1.01 ±0.02 18 ℃5.02 ±0.36#18 ℃+BCTC 15 μm1.18 ±0.20*18 ℃+TRPM8 shRNA1.02 ±0.18*18 ℃+scramble shRNA4.40 ±0.10*

3 討論

COPD 的急性發(fā)作是導致其高病死率的重要原因，其急性發(fā)作的誘因及機制尚不完全清楚。其中寒冷是加重患者癥狀和誘發(fā)其發(fā)作的重大因素，反復冷空氣刺激與高死亡率密切相關［2］。研究發(fā)現(xiàn)，細胞膜上存在一類跨膜通道蛋白-瞬時型感受器電位蛋白(transient receptor potential，TRP)，其亞型TRPM8 蛋白為一種冷激活的溫度感覺通道，能被冷刺激和左旋薄荷醇、桉葉腦等冷卻劑激活［4-5，9］，導致細胞因子及趨化因子的產生［10-11］。

TRPM8 是存在于細胞質膜或細胞器膜上的冷敏感通道，是機體感受外界冷刺激的重要受體，在神經(jīng)組織及非神經(jīng)組織中均有廣泛表達，但其確切表達方式和組織分布仍不是很清楚［11-14］。作為內臟的支氣管肺系統(tǒng)受到表達TRPM8 受體的迷走傳入神經(jīng)支配，可引起植物神經(jīng)反射，增加氣道阻力另有報道［15］。對于TRPM8 受體在寒冷所誘發(fā)的呼吸道疾病中所起的作用，目前僅局限于對人肺氣道上皮細胞及肺內迷走傳入神經(jīng)的初步研究。

本實驗發(fā)現(xiàn)，TRPM8 陽性染色細胞位于支氣管黏膜上皮內，TRPM8 蛋白主要位于支氣管黏膜上皮基底細胞或小顆粒細胞的細胞膜，部分分布于柱狀上皮細胞或杯狀細胞的細胞膜及胞質，尤其是靠近管腔一側。COPD 組的支氣管黏膜上皮內TRPM8蛋白表達量、TRPM8 mRNA 均顯著高于對照組。提示COPD 患者支氣管黏膜上皮存在TRPM8 通道蛋白的高表達。冷刺激可誘導16HBE 胞內［Ca2+］濃度迅速升高，BCTC、TRPM8 shRNA 轉染可阻斷冷刺激誘導的胞內Ca2+濃度升高，故證明TRPM8 是一個可被低溫激活的特異性冷敏感受體，呼吸道黏膜上皮內的TRPM8 受體可感知冷空氣從而誘導一系列病理生理改變。在有基礎炎性反應的氣道中，TRPM8 蛋白呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)及Ca2+水平升高，在一定程度上能解釋為何在受到冷空氣影響時，COPD等慢性氣道炎性反應患者比正常人更易出現(xiàn)急性加重，其機制還有待進一步明確。在國內首次證實了COPD 患者支氣管黏膜上皮TRPM8 受體的高表達，這為吸入冷空氣誘發(fā)的氣道炎性反應及哮喘機制提供了一個新的研究視角。

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