葛正行，周 洵，高 瑞，李 波

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴州貴陽550001)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是呼吸系統(tǒng)常見病，其重要病理特征氣道重塑［1］，是COPD 氣流不完全受限的主要原因。但其機(jī)制尚未完全闡明，治療上亦缺乏有效的對(duì)策，是近年來COPD 研究的熱點(diǎn)和前沿問題之一。

細(xì)胞增殖抑制基因(Hyperplasia Suppressor Gene，HSG)是溫紹君等發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因。研究發(fā)現(xiàn)HSG 可以有效地阻遏細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞增殖［2］。2001年，在肺組織中也克隆出HSG。該基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)認(rèn)識(shí)和治療各種細(xì)胞增殖性疾病分子機(jī)制開辟了一條新途徑。目前，針對(duì)HSG 的研究主要集中在心血管疾病方面，而在COPD 氣道重塑方面尚無相關(guān)研究。本研究試探索rHSG 在氣道重塑中所發(fā)揮的作用及其調(diào)控的機(jī)制，為進(jìn)一步深入干預(yù)COPD 氣道重建機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

脂多糖(LPS)和DMSO(Sigma 公司);黃果樹香煙(焦油13 mg，尼古丁1.1 mg)(貴陽黃果樹卷煙廠);ELISA 試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司);0.25%胰蛋白酶(杭州吉諾公司);高糖培養(yǎng)基和優(yōu)級(jí)胎牛血清(Hyclone 公司);胰蛋白酶粉劑(AMRESCO 公司);HSG 抗體和α-actin(Genway 公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組和模型建立:清潔級(jí)，12 周，體質(zhì)量50 g 左右雄性SD 大鼠［第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCX(渝2007-0000)］，120只，于貴陽中醫(yī)學(xué)院SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(60 只)和COPD 組(60只)。采用熏香煙加氣管注入LPS 法造模，給藥方法參考文獻(xiàn)［3］，對(duì)照組，1、14 d 經(jīng)氣管注入300 μL 0.9%氯化鈉注射液。2 組大鼠于相同正常動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)至80 d。

1.2.2 大鼠肺功能測(cè)定:隨機(jī)選取對(duì)照組及模型組大鼠各15 只。將大鼠用2%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g 體質(zhì)量腹腔內(nèi)麻醉后，仰臥位置于密閉體描箱內(nèi)，其呼吸借助一端與插管連接，另一端與體描箱外動(dòng)物呼吸機(jī)的皮管連接。動(dòng)物呼吸時(shí)一個(gè)傳感器受動(dòng)物氣道內(nèi)壓力的變化，另一個(gè)傳感器感受體描箱內(nèi)壓力的變化并通過放大器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，經(jīng)電腦處理后計(jì)算出大鼠的肺順應(yīng)性(Cdyn)、氣道阻力(RI)。

1.2.3 肺泡灌洗液中TGF-β1 的檢測(cè):隨機(jī)選取對(duì)照組及模型組大鼠各30 只。取肺泡灌洗液用雙抗體夾心(ABC-ELISA)法檢測(cè)TGF-β1。

1.2.4 氣道成纖維細(xì)胞的培養(yǎng):取對(duì)照組及模型組大鼠各15 只，取肺組織切為約0.53～1 mm3的小塊，于培養(yǎng)瓶中加入15%胎牛血清DMEM(高糖)培養(yǎng)基絕對(duì)靜止培養(yǎng)。1 周后可見成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿并匯合成單層，用PBS 洗兩遍后加0.25%胰蛋白酶1 mL 37 ℃消化2 min 后，加入2 mL 含15%胎牛血清高糖DMEM 培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min 離心5 min，以(2～3)×107/L 接種到培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，用差時(shí)貼壁法提純細(xì)胞。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)rHSG 在氣道成纖維細(xì)胞中的表達(dá):調(diào)整細(xì)胞濃度至3 ×105個(gè)/mL，收集蛋白，配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白濃度。確保每孔上樣量為30 μg。用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓120 V，時(shí)間2 h。隨后用PVDF 膜轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)移條件230 mA 恒流，時(shí)間150 min。轉(zhuǎn)膜完畢后用3%血清——TBS-T 封閉60 min。分別是使用HSG 抗體(1∶1 000)與α-actin(1∶3 000)，4 ℃，孵育12 h。用TBS-T 洗10 min，共洗3 次。再加二抗，與封閉液比例均為1∶2 000，室溫孵育2 h。以TBST 洗10 min，共洗3 次。rHSG 于30、45 和1 min 分別壓1 張;α-actin 壓10 s。所得膠片結(jié)果掃入計(jì)算機(jī)用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度測(cè)定，隨后計(jì)算出所需值。

1.2.6 RT-PCR 檢測(cè)rHSG 基因在成纖維細(xì)胞中的表達(dá):細(xì)胞分組處理同上，提取細(xì)胞中RNA。rHSG上游引物序列為:5'-GGAGCTGGACAGCTGGATTGA T-3'，下游引物序列為:5 '-AGCTCCAGCTGCTTGT CCATGA-3'，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度609 bp。同時(shí)以擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度278 bp 的β-actin 作為內(nèi)參照，β-actin 上游引物序列為:5'-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3'，下游引物序列為:5 '-GCTCAGTAACAGTCCGCCTA-3'。RT-PCR 反應(yīng)條件為:48 ℃45 min，94 ℃2 min，1個(gè)循環(huán);94 ℃30 s，61 ℃45 s，72 ℃80s，35 個(gè)循環(huán);72 ℃最終延伸7 min 后終止反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠水平電泳，EB 染色，凝膠成像儀照相，Quantity one4.3.1 凝膠分析系統(tǒng)對(duì)各電泳條帶的亮度和面積進(jìn)行分析，最后得出各條帶總信(adjustVolume)，結(jié)果以rHSG/β-actin 的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差描述，各均數(shù)之間的比較采用單因方差分析(one-way AVOVA)，兩兩比較采用Neuman-Keuls 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物造模一般情況

模型組大鼠早期出現(xiàn)躁動(dòng)不安，精神萎靡、行動(dòng)遲緩、納少和毛發(fā)枯黃等癥，隨著時(shí)間推移出現(xiàn)咳嗽、氣急、痰多和甚至喘鳴。后期出現(xiàn)體質(zhì)量較對(duì)照組減輕;肺體積略增大，表面蒼白不平;多數(shù)肺組織橫截面可見焦油點(diǎn)散在分布。對(duì)照組飲食飲水良好，體型增大明顯，皮毛光澤度好，活動(dòng)能力強(qiáng)，精神狀態(tài)良好。

2.2 大鼠肺功能及肺泡灌洗液中TGF-β1 的檢測(cè)

模型組氣道阻力(RI)明顯高于對(duì)照組，而其肺順應(yīng)性(Cdyn)卻明顯下降(P＜0.05)。在模型組肺泡灌洗液中TGF-β1 含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)(表1)

表1 對(duì)照組與模型組肺功能和TGF-β1 比較Table 1 The comparison of lung function of TGF-β1 between the control group and model group

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及rHSG mRNA 和蛋白在其中的表達(dá)

2.3.1 氣道成纖維細(xì)胞的培養(yǎng):原代肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)7～12 d 即有新生成纖維細(xì)胞型貼壁生長(zhǎng)。開始細(xì)胞形態(tài)多樣化，但多為類圓形，帶有粗大突起(圖1A)，之后變?yōu)殚L(zhǎng)梭形、條索狀，繼而匯合成片(圖1B)，之后彼此連接成網(wǎng)狀，分界較為模糊(圖1C)。

圖1 培養(yǎng)的氣道成纖維細(xì)胞Fig 1 Trained of airway fibroblasts(×100)

2.3.2 兩組成纖維細(xì)胞中rHSG mRNA 和蛋白表達(dá)的比較:模型組rHSG mRNA 和蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(圖2，圖3;表2)。

圖2 rHSG mRNA 在兩組成纖維細(xì)胞中的表達(dá)Fig 2 rHSG mRNA expressed in two groups of fiber cells

圖3 rHSG 蛋白在兩組成纖維細(xì)胞中的表達(dá)Fig 3 rHSG protein expressed in two groups of fiber cells

2.4 rHSG mRNA 和蛋白與TGF-β1、肺功能RI、Cdyn 的相關(guān)性

運(yùn)用線性回歸分析rHSG mRNA 與TGF-β1 呈負(fù)相關(guān)(r= －0.42，P＜0.05)，與肺功能RI 呈負(fù)相關(guān)(r = －0.42，P＜0.05)，與Cdyn 呈正相關(guān)(r =0.37，P＜0.05)。

表2 rHSG mRNA 和蛋白在兩組大鼠中表達(dá)比較Table 2 rHSG mRNA and protein expression inthe two groups of rats

rHSG 蛋白與TGF-β1 呈負(fù)相關(guān)(r = － 0.42，P＜0.05)，與RI 呈負(fù)相關(guān)(r = －0.42，P＜0.05)，與Cdyn 呈正相關(guān)(r=0.39，P＜0.05)。

3 討論

氣道重塑是COPD 病程發(fā)展的關(guān)鍵，主要是由于小氣道周圍纖維組織增生、管腔狹窄、塌陷，導(dǎo)致管壁僵硬，閉塞，最終導(dǎo)致阻塞性肺氣腫、慢性肺心病，由此可以認(rèn)為氣道重建是成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡失去平衡的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)TGFβ1 在正常人、慢性支氣管炎患者支氣管黏膜活檢標(biāo)本中的表達(dá)較健康對(duì)照組顯著增多，且TGF-β1 與成纖維細(xì)胞數(shù)量和基底膜明顯相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)能夠合成TGF-β1 的還有嗜酸粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞［4］?？梢奣GF-β1 與成纖維細(xì)胞的相互作用在COPD 發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。而HSG 作為一種與參與細(xì)胞增殖與凋亡的基因，有可能參與了氣道重塑中成纖維細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的增殖。

研究表明，rHSG 基因在對(duì)照組成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，在模型組中低表達(dá)，說明其在COPD 大鼠模型氣道成纖維細(xì)胞增生中有抑制增殖作用。結(jié)果顯示，其與TGF-β1 呈負(fù)相關(guān)，與RI 成負(fù)相關(guān)，與Cdyn成正相關(guān)，說明rHSG 與氣道氣流受限關(guān)系密切，而且可能通過調(diào)控TGF-β1 來發(fā)揮其增殖抑制作用。進(jìn)而證明了其在氣道重塑中抑制增殖的作用。而rHSG 基因調(diào)控COPD 大鼠氣道重塑的具體信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

［1］李園.營(yíng)養(yǎng)支持在慢性阻塞性肺疾病中的治療療效觀察［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2011，32:23-24.

［2］溫紹君，王佐廣，陳光慧，等.HSG 基因單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2005，39:15-17.

［3］宋小蓮，王昌惠，白沖脂多糖結(jié)合熏煙法和單純熏煙法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型的比較［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31:246-249.

［4］Polikepahad S，Moore RM，Venugopal CS.Endothelins and airways a short review［J］.Res Common Mol Pathol Pharmacot，2006，6:491-492.