王洪權(quán)，王玉敏，崔其福，趙偉麗，成 龍

(赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1.神經(jīng)內(nèi)科;2.腫瘤內(nèi)科，內(nèi)蒙古赤峰024005;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理研究中心，北京100097)

氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)損傷在帕金森病(Parkinson's disease，PD)的發(fā)病機(jī)制及其多巴胺能神經(jīng)元死亡中發(fā)揮重要作用［1］。針對(duì)抗OS 的策略則成為PD 有效的治療途徑。

研究顯示上調(diào)HO-1 的表達(dá)具有廣泛的細(xì)胞保護(hù)作用。HO-1 在帕金森病中的作用引起了廣大研究者的注意［2-3］。一些化合物通過(guò)誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)可在帕金森疾病模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［4］。因此鑒定出具有誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)的化合物成為目前國(guó)際的研究熱點(diǎn)。類葉升麻苷(acteoside，AS)是一種糖苷類，具有神經(jīng)保護(hù)活性，其可以抑制1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷［5-6］，但其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本研究探討AS 是否能夠在PC12 細(xì)胞中上調(diào)HO-1 的表達(dá)，明確后者上調(diào)是否參與其對(duì)MPP+誘導(dǎo)損傷的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

類葉升麻苷(winherb medical technology Inc)，HO-1 抗體(#SPA895，Stressgen)，HO-1 抑制劑鋅原卟啉ZnPP(SC-200329)和免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(Santa cruz)，PVDF 膜(Millpore 公司)。MTT 和MPP+(Sigma 公司)。

1.2 細(xì)胞存活率的檢測(cè)

MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力，參照文獻(xiàn)［7］。PC12 細(xì)胞(ATCC)接種在含5% 胎牛血清，10% 馬血清，100U/ml 青霉素，100μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中(pH7.2)，37℃，5% CO2 溫育。

1.3 RT-PCR 檢測(cè)HO-1 mRNA 表達(dá)

Trizol 提取總RNA。HO-1 和β-actin PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃2 min，94 ℃30 s，54 ℃30 s，和72 ℃45 s 共25 循環(huán)。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成引物，擴(kuò)增出的片段大小為HO-1(322 bp)，β-actin(494 bp)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色，紫外下拍照記錄。

1.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)HO-1表達(dá)

依據(jù)參照文獻(xiàn)［8］中方法。使用RIAP 緩沖液裂解細(xì)胞，用BCA 試劑測(cè)定蛋白含量，通過(guò)電泳緩沖液調(diào)整各組含量為5 μg /L，每個(gè)樣本上樣量為50 μg，在10%聚丙烯酞胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量確定蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)位置。用含10%脫脂奶粉吐溫鹽緩沖液(TBS)液封閉，TBS 洗15 min×3;加入1 抗，4 ℃振蕩孵育過(guò)夜，TBST 洗10 min×3;1∶10 000 加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)的二抗，37 ℃振蕩孵育1 h，TBS洗10 min×3;按ECL 試劑盒進(jìn)行熒光顯色反應(yīng)。暗室中曝光，顯影，定影。用分析軟件Bio-Rad 分析每個(gè)條帶的吸光度值，以目的蛋白豐度/β-actin 蛋白吸光度比值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。以β 肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，計(jì)算待測(cè)蛋白條帶積分吸光度與β 肌動(dòng)蛋白的比值，表示待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 免疫熒光檢測(cè)HO-1 在細(xì)胞內(nèi)定位

參照文獻(xiàn)中的方法［9］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 類葉升麻苷抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率的下降

1 mmol/L MPP+作用PC12 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著下降(P＜0.05)。AS(20 和30 μmol/L)預(yù)處理2 h 后，可明顯抑制MPP+所導(dǎo)致的細(xì)胞存活率的下降(P＜0.05)(圖1)。

2.2 類葉升麻苷在PC12 細(xì)胞中誘導(dǎo)HO-1 的表達(dá)

20 和30 μmol/L AS 可明顯上調(diào)HO-1 mRNA(圖2A，表1)。AS 可以誘導(dǎo)HO-1 蛋白的表達(dá)(圖2B，表1)。

圖1 類葉升麻苷對(duì)MPP +誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞存活率的影響Fig 1 The effect of acteoside on MPP + induced cell viability in PC12 cells(±s，n=3)

圖2 類葉升麻苷誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞HO-1 的表達(dá)Fig 2 Acteoside induces HO-1 expression in PC12 cells(±s，n=3)

表1 類葉升麻苷誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞HO-1 的表達(dá)Table 1 Acteoside induces HO-1 expression in PC12 cells(±s，n=3)

表1 類葉升麻苷誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞HO-1 的表達(dá)Table 1 Acteoside induces HO-1 expression in PC12 cells(±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control.

groupHO-1 mRNAHO-1 protein control100 ±18100 ±41 AS 1 μmol/L137 ±26163 ±70 AS 20 μmol/L226 ±48*322 ±67*AS 30 μmol/L339 ±73＊＊380 ±126＊＊

2.3 類葉升麻苷誘導(dǎo)HO-1 蛋白的表達(dá)位于胞質(zhì)內(nèi)

AS 可在PC12 細(xì)胞中誘導(dǎo)HO-1 的表達(dá)，而HO-1 的表達(dá)升高主要集中在胞質(zhì)內(nèi)(圖3)。

圖3 免疫熒光染色顯示類葉升麻苷在PC12 細(xì)胞誘導(dǎo)HO-1 蛋白的表達(dá)Fig 3 Acteoside induces HO-1 protein expression in PC12 cells by immunochemical staining

2.4 類葉升麻苷通過(guò)上調(diào)HO-1 表達(dá)抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷

AS(30 μmol/L)預(yù)處理2 h 后，可明顯抑制MPP+所導(dǎo)致的細(xì)胞存活率的下降(P＜0.05)(圖4)，而HO-1 抑制劑ZnPP 可以減弱AS 對(duì)MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的抑制作用(P＜0.05)(圖4)。

圖4 類葉升麻苷通過(guò)上調(diào)HO-1 表達(dá)抑制MPP +誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷Fig 4 Acteoside protect against MPP + induced neurotoxicity by upregulating HO-1 expression(±s，n=12)

3 討論

血紅素加氧酶-1 (heme oxygenase-1，HO-1)是一個(gè)具有保護(hù)作用的在應(yīng)激早期發(fā)揮反應(yīng)的抗氧化酶蛋白，其參與游離血紅素(Heme)降解的限速酶，其分子質(zhì)量為32 ku，HO-1 催化血紅素產(chǎn)生CO、膽綠素和游離鐵［13］。大量研究表明，其細(xì)胞保護(hù)作用引起了廣大研究者的注意［10-11］。HO-1 在PD 中具有神經(jīng)保護(hù)作用［14］。最近研究顯示，通過(guò)藥理學(xué)途徑上調(diào)HO-1 表達(dá)可抑MPP+引起的神經(jīng)毒性損傷。蝦青素(astaxanthin)可通過(guò)促進(jìn)HO-1 的表達(dá)從而保護(hù)PC12 細(xì)胞受MPP+介導(dǎo)的NOX2 來(lái)源的ROS 氧化損傷［12］。1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖通過(guò)PI3K 和ERK/Nrf2 通路促進(jìn)HO-1 的表達(dá)從而保護(hù)PC12 細(xì)胞受MPP+介導(dǎo)的氧化損傷［4］。

類葉升麻苷具有神經(jīng)保護(hù)活性。AS 在帕金森病模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用，AS 可通過(guò)抗氧化和抗凋亡機(jī)制抑制MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷［5-6］。上調(diào)HO-1 表達(dá)在PD 具有神經(jīng)保護(hù)作用。因此本研究以HO-1 為切入點(diǎn)，研究AS 的新的藥理學(xué)作用。發(fā)現(xiàn)類葉升麻苷可在體外誘導(dǎo)HO-1 mRNA 和蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步免疫熒光染色顯示類葉升麻苷可在PC12 細(xì)胞中誘導(dǎo)HO-1 的表達(dá)，而HO-1 的表達(dá)升高主要集中在胞質(zhì)內(nèi)。HO-1 抑制劑ZnPP 可以減弱類葉升麻苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的抑制作用，這表明HO-1 表達(dá)上調(diào)參與類葉升麻苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的抑制作用機(jī)制。

綜上所述，本研究鑒定出類葉升麻苷為一個(gè)新的誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)的新的化合物。本研究闡明了類葉升麻苷新的藥理作用，即其可通過(guò)上調(diào)HO-1 的表達(dá)抑制MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷。為進(jìn)一步探討其抑制氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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