文曦琳，李 易，葛曉東，李妹玲，文 明，李少林

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，重慶400016)

卵巢癌是一種嚴(yán)重威脅女性生命的惡性腫瘤，病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首［1］，因其深居盆腔，早期診斷極為困難，大部分患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已達(dá)病程晚期，目前雖然采用以外科手術(shù)及化學(xué)治療為主的綜合治療，但其5年生存率仍低于40%［2］，因此迫切需要尋求新的治療策略。

新興的分子影像學(xué)是一項(xiàng)從分子或細(xì)胞水平對機(jī)體病理和生理變化進(jìn)行成像的技術(shù)，它在疾病的早期診斷、精確定位及進(jìn)行療效監(jiān)測等方面，有著巨大的開發(fā)及應(yīng)用前景［3］。以RNAi(RNA 干擾)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因治療，因特有的高效性、特異性和無創(chuàng)性，受到越來越多的關(guān)注，成為治療惡性腫瘤的新方向［4］。本研究將兩種技術(shù)結(jié)合，以多聚賴氨酸修飾的超順磁性葡聚糖四氧化三鐵納米粒子(SPIO-PLL)作為MR 陰性對比劑及載體，連接靶向卵巢癌表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因的質(zhì)粒pGenesil1-shRNA，構(gòu)建集診斷和治療于一體的特異性雙功能分子探針(即SPIO-PLL-pshRNA 探針，以下簡稱探針)，并初步評價(jià)其體外轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

SPIO-PLL 由本研究組自制(方法另文報(bào)道)，重組質(zhì)粒pGenesil1-shRNA(含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP報(bào)告基因，上海生物工程公司合成)，卵巢癌SKOV3 細(xì)胞系(中科院上海細(xì)胞庫)，RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone 公司)，瓊脂糖(Hydragene公司)，Cell counting kit-8(CCK-8)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 探針的最佳質(zhì)量比確定(已申請國家專利):在中性條件下，將SPIO-PLL 與質(zhì)粒分別按不同質(zhì)量比(0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1 和10∶1)混合，上下吹打混勻，室溫下放置30 min。瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn):配制1%瓊脂糖凝膠溶液，待冷卻至60 ℃左右，加入核酸染料，混勻、灌膠。分別取10 μL 各組樣品及2 μL loading buffer 混勻后加入各孔道，并設(shè)置SPIO/pshRNA 復(fù)合物(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置兩者質(zhì)量比為6∶1)及質(zhì)粒作為陰性及空白對照。將膠板置于1 × TAE 緩沖液中，100 V 電壓泳動50 min，取出膠板于紫外透射儀下觀察并照相，觀察不同質(zhì)量比的復(fù)合物結(jié)合情況，選取最佳質(zhì)量比(確定為實(shí)驗(yàn)探針)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):卵巢癌SKOV3 置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至對數(shù)增殖期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并加入適量培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，用于隨后的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況:細(xì)胞接種于6 孔板，置于孵箱中培養(yǎng)，至次日細(xì)胞貼壁率達(dá)70%～80%，吸棄原培養(yǎng)基，將探針及單純質(zhì)粒分別用無血清培養(yǎng)基稀釋后加入各培養(yǎng)孔(每孔質(zhì)粒約4 μg)，5 h 后加入含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4 透射電鏡觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞:取上述探針轉(zhuǎn)染的SKOV3 細(xì)胞，用胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，800 r/min 離心5 min，吸棄上清液，新鮮培養(yǎng)基重懸，12 000 r/min 離心10 min，收集細(xì)胞沉淀，2.5%戊二醛固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，修塊，切片，透射電鏡下觀察。

1.2.5 細(xì)胞毒性檢測:將細(xì)胞按200 μL/孔種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，加入不同濃度探針(設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組探針中鐵的終濃度分別為10、25、50、100 和200 mg/L)，并設(shè)未加探針的細(xì)胞組為對照組(即含鐵濃度為0 mg/L)，每組各設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后取出，于每孔中加入20 μL CCK-8 試劑，再培養(yǎng)2 h，在490 nm 波長的酶標(biāo)儀上(參比波長570 nm，無細(xì)胞的培養(yǎng)基調(diào)零)檢測每孔吸光度值。計(jì)算各組吸光度A 值(±s)，細(xì)胞存活率% =(實(shí)驗(yàn)組A490nm值/ 對照組A490nm值)×100。

1.2.6 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞MR 成像:將探針轉(zhuǎn)染的SKOV3 細(xì)胞組作為實(shí)驗(yàn)組(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置探針中鐵濃度為25 mg/L)，收集于1.5 mL 微量離心管中，加入1%瓊脂糖凝膠迅速吹打混勻，置于4 ℃冰箱冷卻凝固備用。另設(shè)置單純質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SKOV3 細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染的SKOV3 細(xì)胞，瓊脂糖為對照組。各組設(shè)3 個(gè)平行管，插入自制的小圓形泡沫板上，置于腕關(guān)節(jié)線圈行MR 橫斷位掃描。掃描參數(shù):GRE T2*WI，TR 240 ms，TE 8.2 ms，F(xiàn)OV 8 cm，層厚3 mm，矩陣320 ×224，激勵(lì)次數(shù)4，翻轉(zhuǎn)角20°。掃描圖像傳至GE ADW 4.0 工作站，測量各管信號強(qiáng)度(即T2*值)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD 法。

2 結(jié)果

2.1 探針的最佳質(zhì)量比

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖1)顯示了不同比例SPIO-PLL 納米粒與質(zhì)粒pGenesil1-shRNA 的結(jié)合情況，對照組1 孔(質(zhì)粒組)和2 孔(SPIO/pshRNA 組)以及實(shí)驗(yàn)組3～7 孔均可見到白色亮條帶泳出，其中肉眼可見6～7 孔泳出的DNA 條帶逐漸減弱滯后，相應(yīng)孔中的DNA 亮帶開始出現(xiàn)，而從8 孔(6∶1)開始，未見明顯DNA 條帶泳出，點(diǎn)樣孔中可見白色的DNA 條帶滯留。確定探針的最佳質(zhì)量比為PLLSPIO∶質(zhì)粒=6∶1。

圖1 不同比例SPIO-PLL-pshRNA 復(fù)合物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 Agarose gel electrophoresis pattern of SPIO-PLLpshRNA complexes at different weight ratios

2.2 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

探針轉(zhuǎn)染的SKOV3 細(xì)胞組，視野內(nèi)散在分布點(diǎn)狀或條片狀綠色熒光(圖2)，而單純質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組視野內(nèi)未見到綠色熒光。

圖2 探針轉(zhuǎn)染SKOV3 細(xì)胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果Fig 2 SKOV3 cells transfected with probes，observed by fluorescence microscope(×100)

2.3 透射電鏡觀察結(jié)果

探針轉(zhuǎn)染后的SKOV3 細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)存在多個(gè)散在或成團(tuán)分布的高密度黑色鐵顆粒，細(xì)胞核內(nèi)未見鐵顆粒(圖3)。

圖3 探針轉(zhuǎn)染的SKOV3 細(xì)胞電鏡圖Fig 3 TEM images of SKOV3 cells transfected with probes(×12 000)

2.4 細(xì)胞毒性檢測結(jié)果

探針對細(xì)胞毒性具有濃度依賴性，隨著濃度增加，毒性也隨之增加。在探針鐵濃度小于50 mg/L，細(xì)胞存活率大于80%;當(dāng)濃度高于50 mg/L，細(xì)胞存活率明顯降低(表1)。

2.5 MR 成像結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組信號強(qiáng)度T2*值為(287 ±12)，而單純質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SKOV3 細(xì)胞組、未轉(zhuǎn)染的SKOV3 細(xì)胞組、瓊脂糖組T2*值分別為(525 ±18)、(548 ±21)、(647 ±14)。實(shí)驗(yàn)組較各對照組T2*值明顯降低(P＜0.01)(圖4)。

表1 不同濃度探針的細(xì)胞毒性檢測結(jié)果Table 1 Cytotoxicity test results of probes at different concentration(±s，n=3)

表1 不同濃度探針的細(xì)胞毒性檢測結(jié)果Table 1 Cytotoxicity test results of probes at different concentration(±s，n=3)

groupprobe concentration(mg/L)A490 nm valuecell viability(%)1 0 0.9317 ±0.0028100.0 ±0.00 2 100.8923 ±0.009395.50 ±1.97 3 250.8400 ±0.017790.19 ±1.60 4 500.7650 ±0.015082.13 ±1.48 51000.6817 ±0.011973.19 ±1.54 62000.5780 ±0.011161.00 ±2.13

圖4 探針轉(zhuǎn)染SKOV3 細(xì)胞后MR 成像結(jié)果Fig 4 MR imaging results of SKOV3 cells transfected with probes

3 討論

在分子影像學(xué)研究中，分子探針的構(gòu)建至關(guān)重要。分子探針的主要結(jié)構(gòu)包括親和組件、信號組件和二者之間的連接物［5］。EGFR 是原癌基因c-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，它在卵巢癌中過度表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和浸潤程度等密切相關(guān)［6］，是卵巢癌診斷和治療的理想靶點(diǎn)。因此，本研究針對EFGR 構(gòu)建干擾質(zhì)粒pGenesil1-shRNA 作為探針的親和組件，進(jìn)入卵巢癌細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄出的shRNA 可通過RNAi 沉默EGFR 基因，從而抑制目的蛋白的表達(dá)。信號組件為MR 負(fù)性對比劑SPIO，它具有粒徑小，細(xì)胞穿透力強(qiáng)，有很好的磁響應(yīng)性及生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)［5］。中間連接物為帶正電的PLL，它是最早用于基因轉(zhuǎn)染的陽離子聚合物［7］，經(jīng)其修飾的SPIO 可通過靜電吸附結(jié)合帶負(fù)電的質(zhì)粒［8］。

瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)可檢測不同質(zhì)量比SPIOPLL 和質(zhì)粒的結(jié)合情況，由于二者結(jié)合后比重增大及表面電荷的改變，其隨電流的遷移較游離DNA 會受到明顯的阻礙，因此DNA 亮帶的位置會產(chǎn)生相應(yīng)變化，而SPIO 因帶負(fù)電不能與直接與質(zhì)粒結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示SPIO-PLL 與質(zhì)粒的結(jié)合率隨著其比例增大而增加，當(dāng)兩者比例達(dá)6∶1 時(shí)，即可有效結(jié)合，確定該比例為制備探針的最佳質(zhì)量比。

探針能否順利進(jìn)入腫瘤細(xì)胞是進(jìn)行后續(xù)研究的基礎(chǔ)。探針中的質(zhì)粒載體pGenesil-1 含EGFP 報(bào)告基因，它進(jìn)入細(xì)胞且成功表達(dá)后可于熒光顯微鏡下看見綠色熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針可順利進(jìn)入卵巢癌細(xì)胞，并檢測到探針中的SPIO 顆粒分布于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。探針對細(xì)胞是否存在毒性會對目的基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)制備的探針中SPIO 主要成分為鐵，PLL 是一種含賴氨酸殘基的多肽聚合物，兩者均具有生物可降解性及低細(xì)胞毒性，且研究顯示兩者結(jié)合后毒性還可進(jìn)一步降低［9-10］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)探針的細(xì)胞毒性小，且在低于50 mg/L 的鐵濃度范圍內(nèi)，對細(xì)胞活力沒有明顯影響。探針中SPIO作為MR 負(fù)性對比劑，能縮短T1 和(或)T2 弛豫時(shí)間，引起MR 信號降低，其中T2*WI 序列對檢測細(xì)胞內(nèi)SPIO 更敏感［11］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明探針在較低濃度下轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，即可被MR 敏感檢測。綜上，本研究已成功制備針對卵巢癌的SPIO-PLLpshRNA 探針，為隨后的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

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