覃 敏，黃 林，李慕軍，莫曾南*

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院1.人類精子庫;2.生殖醫(yī)學研究中心，廣西南寧530021)

男性不育癥總發(fā)病率逐年升高，其中精子形態(tài)異常引起的不育或生殖力低下的占男方因素的30%～40%［1］。目前，能有效治療男性不育癥的方法是輔助生殖技術(shù)，但對于內(nèi)源性生殖細胞缺如無精子癥或精子畸形綜合征患者，ART 或藥物治療無效［2］。胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)可誘導分化為成體器官不同胚層的所有細胞，因此誘導ESCs 在體外分化為雄性生殖細胞，可以為生殖發(fā)生提供一個理想的平臺［3］。而結(jié)合胚胎干細胞技術(shù)和體細胞核移植技術(shù)，可在體外培育出與患者遺傳特征完全相同的核移植胚胎干細胞(nuclear transfer embryonic stem cells，NT-ESCs)，為男性不育提供種子細胞的新來源。

NT-ESCs 理論上可分化為各個組織，但男性生殖細胞分化的研究尚少［4-5］。本研究旨在探討雄性生殖細胞定向誘導分化條件及分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性C57BL/6 小鼠25 g，雌性BALB/c 小鼠25 g［上海斯萊克動物有限公司，許可證號:SCXK(滬)2003-000］。RA、LIF、H-DMEM、bFGF、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、絲裂霉素C 等(Sigma 公司)。cleavage medium、blastocyst medium(Sage BioPharma公司)。

1.2 NT-ESCs 的培養(yǎng)和鑒定

構(gòu)建核移植胚胎并檢測其DNA 來源［6］。重構(gòu)胚常規(guī)培養(yǎng)，挑取形態(tài)典型，未分化的NT-ESCs 集落傳代。經(jīng)形態(tài)學、堿性磷酸酶(AKP)染色、核型分析、類胚體實驗、體內(nèi)分化方法鑒定。

1.3 NT-EBs 細胞誘導分化

培養(yǎng)3～4 d 后的NT-EBs 接種于鋪有0.1%明膠的24 孔板。加入含2 μmol /L RA、1 000 U/mL LIF、20 ng/ mL 成纖維細胞生長因子、30 ng/mL 干細胞生長因子、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、0.1 mmol/L β 巰基乙醇，2 mmol/ L 谷氨酰胺的高糖DMEM 培養(yǎng)液，誘導其向雄性生殖細胞分化，觀察NT-EBs 生長和形態(tài)變化。設4 組對照組:1)未分化的NT-ESCs;2)分化培養(yǎng)前的NT-EBs;3)無共培養(yǎng)、自主分化的NT-EBs;4)小鼠胚胎成纖維細胞。

1.4 RT-PCR 法檢測誘導后雄性生殖細胞發(fā)育相關(guān)基因的表達

收集培養(yǎng)的NT-EBs 提取總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列及退火溫度見表1。PCR 參數(shù):95 ℃預變性4 min，94 ℃45 s，55 ℃～67 ℃45 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán)，72 ℃10 min。產(chǎn)物電泳，結(jié)果以目的基因/β-actin 條帶密度比值表示(n=6)。

1.5 間接免疫熒光染色法檢測VASA、Scp3 蛋白的表達

共培養(yǎng)12 d 后按間接免疫熒光法，檢測分化組和對照組NT-EBs 的VASA、Scp3 蛋白表達，顯微鏡下觀察并照相。判斷標準:(－)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱，但清楚可見;(+ +)熒光明亮;(+ + +～+ + + +)熒光閃亮。

表1 引物序列和退火條件Table 1 Primer sequences and annealing temperature

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 NT-ESCs 的鑒定

NT-ESCs 呈橢圓形或鳥巢狀細胞集落，邊緣清晰(圖1);AKP 染色呈強陽性，集落呈深藍色(圖2A);細胞具有20 對染色體核型的結(jié)構(gòu)(圖2B);NT-ESCs懸浮培養(yǎng)能形成簡單的NT-EBs，較為致密，形態(tài)規(guī)則(圖2C);體內(nèi)注射NT-ESCs 可形成畸胎瘤，腫瘤包含源自3 個胚層分化的衍生物(圖2，D，E，F(xiàn))。

2.2 NT-EBs 體外誘導的生長觀察

NT-EBs 呈圓球狀懸浮于ESCs 培養(yǎng)液，細胞透亮活性好，大小比較均一，內(nèi)部細胞致密，邊緣規(guī)則(圖3A)。分化培養(yǎng)第4 天部分細胞由梭形或桿狀變?yōu)閳A錐形，培養(yǎng)7 和12 d 的細胞增殖能力強，大而圓形細胞增多(圖3C，D)。

2.3 RT-PCR 檢測雄性生殖細胞標志物的表達

圖1 NT-ESCs 形態(tài)學特征Fig 1 The morphology of NT-ESCs

圖2 NT-ESCs 的鑒定Fig 2 Identification of NT-ESCs

誘導12 d 后的NT-EBs 能夠表達雄性生殖細胞相關(guān)的特征基因(VASA、Scp3、Sry、Tex14)。與未分化NT-ESCs(0.68 ± 0.03)相比，誘導后Oct4 的mRNA相對表達量為0.31 ±0.06，呈下調(diào)趨勢;Vasa，Scp3 和Sry mRNA 相對表達量為:1.03 ±0.08、0.95 ±0.07、1.03 ±0.06，明顯上調(diào)(P＜0.05)。在誘導前和自然分化的NT-EBs 中幾乎未能檢測到Texl4 的表達。小鼠胚胎成纖維細胞均不表達上述相關(guān)基因(圖4)。

圖3 NT-EBs 體外誘導的生長觀察Fig 3 Morphology of NT-EBs cultured in vitro

圖4 RT-PCR 檢測雄性生殖細胞標志物的表達Fig 4 mRNA expression of the genes involved in male germ cells development in NT-ESCs(RT-PCR)

2.4 NT-EBs 細胞VASA 和Scp3 蛋白的表達

誘導后第12 天即可見NT-EBs 細胞表達VASA(+)和Scp3 (+)，細胞成簇分布，部分細胞呈現(xiàn)一字形排列;在自然分化對照組NT-EBs 中，未見Scp3 陽性細胞，微弱表達VASA (±)(圖5)。

圖5 NT-EBs 細胞VASA 和Scp3 的表達Fig 5 VASA and Scp3 positive cells in NT-EBs(×200)

3 討論

多項研究提示，由ESCs 獲得精子的技術(shù)是可行的［5，7］，基于體細胞核移植技術(shù)與胚胎干細胞技術(shù)NT-ESCs 向男性生殖細胞分化有可能同時解決移植物來源和免疫排斥這兩大難題。本實驗構(gòu)建成功的小鼠NT-ESCs 符合小鼠胚胎干細胞的一系列特性并具有多能性，這為進一步研究組織修復及再生提供了技術(shù)平臺。

雖然ESCs 已證實可誘導分化為雄性生殖細胞，但分化的效率非常低［8］。既往研究大多采用微環(huán)境對ESCs 進行體外誘導，能使細胞在三維空間結(jié)構(gòu)中進行移動并且與微環(huán)境相互作用。例如，用骨形態(tài)發(fā)生蛋白4BMP4、RA 誘導［9-10］，或?qū)SCs體外誘導為原始生殖細胞樣細胞進而分化成雄性生殖細胞［11］。目前使用最多的方法是采用EB 的形式，其含有3 個胚層的細胞類型，提供了三胚層細胞間的相互接觸模型。目前體外形成EB 的微環(huán)境能夠支持生殖細胞的發(fā)育，并能消除生殖細胞發(fā)育早期親緣印跡［12］。在本實驗中我們模擬體內(nèi)微環(huán)境，并經(jīng)RA 誘導增殖，研究了胚胎干細胞的誘導分化情況。

本實驗檢測了4 種NT-ESCs 和雄性生殖細胞發(fā)育相關(guān)基因，Oct4 為NT-ESCs 特異性基因;VASA、Scp3、Sry 和Tex14 這4 個基因為生殖系統(tǒng)特異性表達基因，特別在精子發(fā)生中起著重要作用。經(jīng)誘導后，NT-ESCs 的Oct4 表達減弱，VASA、Scp3、Sry 和Tex14 基因逐漸開始表達，說明RA 可促進NT-ESCs 表達雄性生殖細胞發(fā)育相關(guān)基因。同時，誘導后的NT-ESCs 表達雄性生殖細胞標志蛋白VASA和Scp3，與報道類似［13］。以上結(jié)果提示RA可誘導NT-ESCs 向雄性生殖細胞分化，NT-ESCs 具備向中胚層細胞分化的潛能。但是，本研究分化后的細胞雖表現(xiàn)出雄性生殖細胞的相關(guān)蛋白，僅僅是一種前祖細胞，而非一種特定的生殖細胞。

目前，NT-ESCs 技術(shù)仍具有優(yōu)勢，核移植技術(shù)已可生成人類胚胎干細胞，這一成果具有里程碑意義［14］。因此，進一步精確、規(guī)范、增殖和鑒定分化中所涉及到的重要蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)，篩選出影響誘導分化的關(guān)鍵因素，對NT-ESCs 的定向誘導分化不僅在理論上且在實踐中均具有重要的現(xiàn)實意義。

［1］Moskovtsev SI，Mullen JB，Lecker I，et al.Frequency and severity of sperm DNA damage in patients with confirmed cases of male infertility of different aetiologies［J］.Reprod Biomed Online，2010，20:759-763.

［2］Larson KL，de Jonge CJ，BarnesAM，et al.Sperm chromatin structure assay parameters as of failed pregnancy following assisted reproductive techniques［J］.Hum R eprod，2000，15:1717-1722.

［3］Fadel HE.Developments in stem cell research and therapeutic cloning:Islamic ethical positions，a review［J］.Bioethics，2012，26:128-135.

［4］Jung EM，Son HY，Jeung MK，et al.Epigenetic signatures of somatic cell nuclear transfer-derived embryonic stem cells［J］.nt J Mol Med，2011，28:697-704.

［5］Nayernia K，J Nolte，HW Michelmann，et al.1n vitro differentiated embryonic stem cells give rise to male gametes that can generate offspring mice［J］.Dev Cell，2006，11:125-132.

［6］覃敏，何敏，宣強，等.近交系小鼠體細胞核移植囊胚的微衛(wèi)星DNA 鑒定［J］.基礎醫(yī)學與臨床，2009，29:924-928.

［7］Yu Z，Ji P，Cao J，et al.Dazl promotes germ cell differentiation from embryonic stem cells［J］.J Mol Cell Biol，2009，1:93-103.

［8］Yamano N，Kimura T，Watanabe-Kushima S，et al.Metastable primordial germ cell-like state induced from mouse embryonic stem cells by AKT activation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，392:311-316.

［9］Toyooka Y，Tsunekawa N，Akasu R，et al.Embryonic stem cells can form germ cells in vitro［J］.Proc Natl Acad Sci，2003，100:11457-11462.

［10］Chen W，Jia W，Wang K，et al.Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，418:571-577.

［11］Greber B，Wu U，Bememann C，et al.Conserved and divergent roles of FUF signaling in mouse epiblast stem cells and human embryonic stem cells［J］.Cell Stem Ce11，2010，8:215-226.

［12］Geijsen N，Horoschak M，Kim K，et al.Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells［J］.Nature，2004，427:106-107.

［13］Celso Silva，Jennifer R.Wood，et al.Expression Profile of Male Germ Cell-Associated Genes in Mouse Embryonic Stem Cell Cultures Treated with All-Trans Retinoic Acid and Testosterone［J］.Mol Reprod Dev，2009，76:11-21.

［14］Tachibana M，Amato P，Sparman M，et al.Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer［J］.Cell，2013，153:1228-1238.