孫曉 郭耀武 楊瑞瑞

1.陜西中醫(yī)學院，陜西咸陽712046；2.陜西省食品藥品檢驗所，陜西西安710065

高效液相色譜法測定六葉龍膽不同部位的龍膽苦苷含量

孫曉1郭耀武2楊瑞瑞2

1.陜西中醫(yī)學院，陜西咸陽712046；2.陜西省食品藥品檢驗所，陜西西安710065

目的采用高效液相色譜法測定六葉龍膽不同部位的龍膽苦苷含量，比較不同部位龍膽苦苷的含量。方法CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為甲醇-0.5%乙酸水溶液（25∶75）；檢測波長為270 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為32℃。結果龍膽苦苷在0.5～6.9 μg范圍內(nèi)呈線性關系，回歸方程為Y=1.2908×106X+ 4.8047×104，相關系數(shù)（r）=0.9999，測定方法的平均回收率為98.56%，RSD=1.01%（n=6）。龍膽苦苷含量測量結果為：花＞根＞莖＞葉＞枯龍膽。結論本研究所采用的高效液相色譜法快速簡便，準確，精密度好；六葉龍膽不同部位中龍膽苦苷含量有較大差異。

高效液相色譜法；六葉龍膽；不同部位；龍膽苦苷

龍膽科龍膽屬植物全世界約有400余種，我國有240余種，分布遍及全國[1]。六葉龍膽（Gentiana hexaphylla Maxim.ex Kusnez.）為龍膽科龍膽屬的多年生草本植物。六葉龍膽出自《青藏藥鑒》，書中記載藏藥名稱為吉解那保。主要分布在中國內(nèi)地的甘肅、西藏、青海、四川、陜西秦嶺等高海拔地區(qū)，主要生長在海拔2500～3500 m的山坡草地、路旁、高山草甸及灌叢中[2]，是秦嶺北坡關中中部的習用草藥之一，目前尚未由人工引種栽培，蘊藏量較大。

已有文獻報道稱龍膽科植物的主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類化合物，包括龍膽苦苷、馬錢酸、獐牙菜苦苷及獐芽菜苷等[3]。其中具有強烈苦味活性的龍膽苦苷是其主要有效成分之一，是龍膽藥苦寒的物質(zhì)基礎[4]，具有保肝、利膽、抗炎、抗過敏、健胃等多種藥理作用，是評價龍膽藥材質(zhì)量的重要指標[5-6]。

近年來龍膽商品藥材使用量加大，但由于長期無序采挖導致野生資源銳減，部分地區(qū)資源枯竭[7]。為擴大藥用資源，本文對六葉龍膽不同部位的主要化學成分龍膽苦苷含量做了比較，對今后合理開發(fā)利用這一藥用植物資源提供指導。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AD型液相色譜儀；色譜柱；CAPCELL PAK C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；電子分析德國賽多利斯Sartorius BP系列天平；KQ500DE臺式數(shù)控超聲波清洗器；大德藥機搖擺式離心機。

1.2 材料與試藥

本文所采用實驗材料六葉龍膽均采自秦嶺，采挖時間為7～9月份，經(jīng)陜西省食品藥品檢驗所郭耀武主任藥師鑒定為龍膽科植物六葉龍膽（Gentiana hexaphylla Maxim.ex Kusnez.），其中編號1的樣品采自戶縣光頭山，編號2的樣品采自周至縣厚畛子，編號3的樣品采自長安縣終南山。

龍膽苦苷對照品（供含量測定用，含量以96.9%計，批號為110770-201013）購自中國藥品生物制品檢定所；實驗過程中所用試劑均為國藥“滬試”牌分析純，流動相為色譜純，微孔濾膜統(tǒng)一為0.45 μm有機系尼龍微孔濾膜，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELLPAKC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.5%乙酸水溶液（25∶75）；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL/min[8]；進樣量：10 μL；柱溫32℃。理論塔板數(shù)以龍膽苦苷計算應不低于4500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取龍膽苦苷對照品10 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，作為對照品溶液，備用[9]。

2.2.2 供試品溶液的制備分取六葉龍膽干燥根、莖、葉、花、全草、枯六葉龍膽等六部分，分別放于旋轉式離心機中粉碎。精密稱取各部位粉末各0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定并記錄重量[10]。考慮到龍膽苦苷自身的不穩(wěn)定性會導致分解從而提取率下降，故超聲處理分為兩階段[11]。第一階段超聲頻率設置為500 W，超聲時間設置為15 min，取出自然冷卻至室溫，第二階段再次超聲15 min，頻率設置依舊為500 W。超聲結束后取出冷卻至室溫后稱定重量，對比超聲前重量記錄，用甲醇補定減失重量。振搖后靜置取上清液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，作為供試品溶液[12-13]。

2.3 系統(tǒng)適應性試驗

按上述色譜條件，將制備好的對照品溶液、供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定，結果供試品溶液在與對照品溶液相同保留時間處有一致的色譜峰，且吸收峰達到基線分離，分離度均大于1.6，理論塔板數(shù)均大于4500，說明上述色譜條件適用于六葉龍膽中龍膽苦苷含量測定。見圖1。

圖1 龍膽苦苷的高效液相色譜圖

2.4 線性關系考察

分別精密吸取對照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，按上述色譜條件依次進樣，以對照品進樣量為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，計算得回歸方程Y=1.2908× 106X+4.8047×104，相關系數(shù)（r）=0.9999，計算結果表明龍膽苦苷在0.5~6.9 μg之間線性關系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取龍膽苦苷對照品溶液10 μL，在上述色譜條件下連續(xù)重復進樣5次，記錄每次峰面積，計算得RSD為1.10%，表明本實驗方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取按上述制備條件制備的對照品溶液和供試品溶液，分別精密吸取10 μL，在18 h內(nèi)各進樣5次，各自記錄峰面積，計算得到對照品溶液的RSD值為0.55%（n=5），結果表明對照品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；供試品溶液的RSD值為0.98%（n=5），表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取同批六葉龍膽樣品按上述方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜測定條件方法，測定，記錄各自峰面積，計算RSD為1.10%（n=6），結果表明，本方法重復性良好。

2.8 回收率試驗

精密稱取已知含量的六葉龍膽全草樣品6份，分別精密加入龍膽苦苷對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。測定并計算其各自的回收率，然后計算得到平均回收率為98.56%，RSD為1.01%（n=6），結果表明，本實驗方法可行。見表1。

表1 龍膽苦苷回收率實驗結果（n=6）

2.9 樣品含量測定

分別取六葉龍膽根，莖，葉，花，全草，枯龍膽干燥粉末，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，各平行制備2份，每份精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀進行含量測定。見表2。

表2 含量測定結果

3 討論

3.1 龍膽苦苷含量測定

《中國藥典》2010年版龍膽項下規(guī)定的龍膽苦苷含量限度龍膽不少于3.0%，堅龍膽不少于1.5%[14-16]。本文六葉龍膽測定結果根含量為1.74%，花含量為2.91%，全草含量1.02%，表明六葉龍膽確有一定的應用價值。

3.2 提取條件研究

3.2.1 提取時間的考察按照“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法，對六葉龍膽提取時間進行考察，分為15、30、45、60 min，結果發(fā)現(xiàn)隨著超聲波提取時間的延長，提取率在30 min前呈上升趨勢，30 min后趨于平緩。

3.2.2 料液比的考察按照“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法，設定料液比為1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，結果發(fā)現(xiàn)隨著提取溶劑比例的不斷加大，提取率呈上升趨勢，并在料液比1∶50后趨于平緩。

3.2.3 提取條件的確定比較靜態(tài)熱回流提取法、動態(tài)熱回流提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等方法各自的提取率。綜合溫度因素對龍膽苦苷穩(wěn)定性的影響，考慮到龍膽苦苷自身的對熱不穩(wěn)定性，可能會導致龍膽苦苷分解從而使提取率下降。最終確定提取條件為：料液比1∶50、超聲處理兩階段。第一階段超聲頻率設置為500 W，超聲時間設置為15 min，取出自然冷卻至室溫，第二階段再次超聲15 min，頻率依舊設置為500 W。

3.3 六葉龍膽采收時間

六葉龍膽根部相比《中國藥典》2010年版收錄的龍膽藥材根部較小，其主要藥理成分龍膽苦苷在六葉龍膽各個部位有所不同，其中以花中含量最大，為2.91%，根中次之，為1.74%，莖葉中龍膽苦苷含量較低，提示應在盛花期7～9月份采挖。

3.4 六葉龍膽入藥部位

六葉龍膽資源主要在秦嶺高海拔區(qū)域分布，六葉龍膽植株較小且全草均含有龍膽苦苷，總體含量在1.0%以上，考慮到藥用植物資源的充分利用，建議以全草入藥，考慮到六葉龍膽往年生的干枯植株根系中龍膽苦苷含量僅為0.1%，故建議在六葉龍膽產(chǎn)地加工時需把根部干枯的植株根系剔除。

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Determination of gentiopicroside in different parts of the Gentiana hexphylla by HPLC

SUN Xiao1GUO Yaowu2YANG Ruirui2
1.Shaanxi University of Chinese Medicine,Shaanxi Province,Xianyang712046,China;2.Shaanxi Institute for Food and Drug Control,Shaanxi Province,Xi′an710065,China

Objective To compare gentiopicroside content in different parts of the Gentiana hexphylla by HPLC,and in order to compare the content of gentiopicrin in different parts.Methods The HPLC analysis was performed on a CAPCELL PAK C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with methanol-0.5%acetic acid(25∶75)as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min;the detection wavelength was at 270 nm;the column oven temperature was set at 32℃.Results The gentiopicroside content showed good linear in the range of 0.5-6.9 μg,regression equation:Y=1.2908×106X+4.8047× 104,correlation coefficient(r)=0.9999.The average recovery was 98.56%,RSD=1.01%(n=6).The sequence of gentiopicroside content was flower＞root＞stem＞leaf＞wither.Conclusion The method of HPLC is quick,simple,accurate,reliable and good precision.There are obvious differences between the kind of different parts of Gentiana hexphylla. [Key words]HPLC;Gentiana hexaphylla;Different parts;Gentiopicroside

R284.1

B

1673-7210（2014）09（a）-0095-04

2014-05-23本文編輯：衛(wèi)軻）

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項課題（編號201207002）；陜西省中醫(yī)管理局中醫(yī)藥科研課題（編號13-ZY054）。

孫曉（1988.2-），男，陜西中醫(yī)學院2012級中藥學專業(yè)在讀碩士研究生。

郭耀武（1963.5-），男，陜西西安人，主任藥師，碩士研究生導師，陜西省食品藥品檢驗所質(zhì)量管理科科長；研究方向：中藥資源與開發(fā)利用。