蘇琢磊 樓田甜 王遠(yuǎn)東 季朝能

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳學(xué)研究所，上海 200433）

人轉(zhuǎn)錄因子hASH4的表達(dá)純化及其DNA結(jié)合活性

蘇琢磊 樓田甜 王遠(yuǎn)東 季朝能

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳學(xué)研究所，上海 200433）

hASH4蛋白所屬的HLH轉(zhuǎn)錄因子家族在調(diào)節(jié)基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期，決定細(xì)胞分化中起了重要作用。有研究表明hASH4蛋白可能與皮膚的分化發(fā)育有著密切的關(guān)系，但具體機(jī)制不明。成功構(gòu)建了pET28b-hASH4表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過對(duì)溫度、時(shí)間、IPTG濃度等表達(dá)條件的優(yōu)化，確定在37℃下1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h可達(dá)到最佳表達(dá)效果，并通過親和層析和弱陽離子交換層析純化蛋白，得到了電泳純的目的蛋白。通過非放射性凝膠滯留試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hASH4蛋白單體只具有非特異性的DNA結(jié)合活性，而不具有特異性的DNA結(jié)合活性，推進(jìn)其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子功能可能需先形成異源二聚體或多聚體才能進(jìn)一步特異性結(jié)合DNA進(jìn)而作用于下游基因。研究結(jié)果為hASH4蛋白的功能和作用方式提供了線索，并為其進(jìn)一步的結(jié)晶條件篩選、晶體結(jié)構(gòu)解析和功能研究奠定基礎(chǔ)。

螺旋-環(huán)-螺旋 堿性/螺旋-環(huán)-螺旋 hASH4 DNA結(jié)合 特異性結(jié)合 非特異性結(jié)合

螺旋-環(huán)-螺旋（Helix-Loop-Helix，HLH）轉(zhuǎn)錄因子家族是真核生物中非常重要的特異性轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族廣泛存在于從酵母到人類的所有真核生物中，其成員在調(diào)節(jié)基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期，決定細(xì)胞分化中起了重要作用［1，2］。大多數(shù)的HLH蛋白屬于堿性/螺旋-環(huán)-螺旋（basic/Helix-Loop-Helix，bHLH）家族成員，即有與HLH結(jié)構(gòu)域相鄰的一個(gè)特殊堿性區(qū)，該堿性區(qū)多數(shù)可以與下游靶基因DNA的特異性序列包括E框基序（CANNTG）或N框基序（CACNAG）結(jié)合從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用，HLH結(jié)構(gòu)域則主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)蛋白的同源或異源二聚化，有利于DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［3-5］。

hASH4（Human achaete-scute homolog 4）基因是Jonsson等［6］最新克隆得到的一段基因，其位于人染色體12q24.1位置，編碼173個(gè)氨基酸，其蛋白結(jié)構(gòu)含有bHLH（堿性/螺旋-環(huán)-螺旋）這一特殊結(jié)構(gòu)域，是HLH轉(zhuǎn)錄因子家族的成員achaete-scute同系物的一員。在當(dāng)前的研究報(bào)道中，hASH4蛋白的表達(dá)主要發(fā)現(xiàn)于人皮膚中，在其他器官如腦等只有十分微量的表達(dá)，而且在胎兒皮膚中蛋白的表達(dá)量是成人皮膚的7倍，固有研究認(rèn)為hASH4蛋白與皮膚的分化發(fā)育有著密切的關(guān)系，但相對(duì)于HLH蛋白家族在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育中所起的作用的研究，其在皮膚發(fā)育中的研究還十分缺乏，并沒有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖C據(jù)證明其如何調(diào)控或者影響著皮膚細(xì)胞的分化［6］。在已有的HLH家族蛋白功能研究報(bào)道中，我們發(fā)現(xiàn)很多HLH蛋白都在各自的表達(dá)區(qū)域起到非常重要的發(fā)育分化調(diào)控作用，且很多跟腫瘤的形成有密切關(guān)系，并有希望能作為腫瘤的治療靶點(diǎn)，如hASH1、Id4等［7-9］。而且對(duì)ASH家族的其他蛋白功能的研究也十分匱乏，hASH2和hASH3跟hASH4有相似的情況，均有可能在皮膚的發(fā)育分化中起到一定的作用［10］。本研究希望通過對(duì)hASH4的bHLH結(jié)構(gòu)域進(jìn)行體外克隆表達(dá)純化，探究其是否具有特異DNA結(jié)合框，為其在體內(nèi)可能的轉(zhuǎn)錄因子功能和作用機(jī)理提供線索，并為hASH4蛋白進(jìn)一步的結(jié)晶條件篩選、晶體結(jié)構(gòu)解析和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人工合成基因hASH4；用于表達(dá)的質(zhì)粒pET28b、E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞及表達(dá)菌株BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存；各種限制性內(nèi)切酶購自New England公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自Axygen公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1hASH4基因的人工合成和酶切鑒定 依據(jù)GenBank中的hASH4基因序列，將hASH4基因中的稀有密碼子改造為大腸桿菌偏愛密碼子。人工合成hASH4基因，在合成基因的上下游分別設(shè)計(jì)NheⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28bhASH4，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliTop 10感受態(tài)細(xì)胞中，在含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)約14 h。挑取單克隆，菌落PCR鑒定正確后，提交Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.2 hASH4蛋白的表達(dá)及誘導(dǎo)條件優(yōu)化 轉(zhuǎn)化鑒定正確的重組質(zhì)粒于表達(dá)菌株BL21（DE3）中，37℃培養(yǎng)12-14 h，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接于100 mL的含50 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL的氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min培養(yǎng)3 h后，將其轉(zhuǎn)接到含50 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL的氯霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37℃，200 r/min）至OD600值為0.6-0.8，加入1.0 mmol/L IPTG對(duì)比在誘導(dǎo)溫度為18℃（12 h）、25℃（8 h）、37℃（4 h）下的誘導(dǎo)情況，確定最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件。

1.2.3 hASH4蛋白的純化

（1）使用親和層析柱（HisTrapTMHP）純化目的蛋白，其操作步驟如下：離心收集的菌體經(jīng)緩沖液（50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，1 mol/L NaCl，10%甘油，pH8.0）重懸浮，經(jīng)壓力破菌儀（循環(huán)2次）破菌，高速離心（15 000 r/min，25 min），收集上清液，加入到平衡后的HisTrap柱，用緩沖液洗滌至無蛋白流出后，使用含有50 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液（50 mmol/L咪唑，50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，1 mol/L NaCl，10%甘油，pH8.0）洗脫非特異性吸附的雜蛋白，再用含250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液（250 mmol/L咪唑，50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，1 mol/L NaCl，10%甘油，pH8.0）梯度洗脫目的蛋白。

（2）使用離子交換層析（HiTrapTMCM FF）進(jìn)一步純化目的蛋白，其操作步驟如下：用20倍體積的Tris緩沖液（10 mmol/L Tris，5%甘油，pH8.0）稀釋從HisTrap柱上洗脫的目的蛋白，平衡弱陽離子交換柱，將稀釋的溶液加入柱中，用緩沖液洗滌至無蛋白流出后，使用含有1 mol/L NaCl的緩沖液（10 mmol/L Tris，5%甘油，1 mol/L NaCl，pH8.0）梯度洗脫目的蛋白。對(duì)純化得到的目的蛋白進(jìn)行SDSPAGE分析并透析超濾保存。

1.2.4 hASH4與DNA結(jié)合活性的研究

（1）通過分子篩試驗(yàn)確認(rèn)純化所得蛋白的存在形式：收集離子交換層析的純化產(chǎn)物，經(jīng)過超濾濃縮至體積小于5 mL，通過微量注射器將蛋白純化產(chǎn)物加入到平衡后的分子篩，使用分子篩緩沖液

（10 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，5%甘油，pH8.0）持續(xù)流過洗柱。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前標(biāo)定的分子篩分子量范圍，按時(shí)收取對(duì)稱的流出峰主峰。根據(jù)流出峰所在位置和流出峰為單峰或雙峰判斷蛋白存在形式。

（2）篩選是否有特異性DNA結(jié)合域：離心收集37℃下1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h的菌體，使用不含NaCl和甘油的緩沖液懸浮，并壓力破菌、高速離心收集上清液后，上樣到平衡后的HisTrap柱，用含有高濃度的NaCl和甘油的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，進(jìn)行DNA電泳，割膠回收一些較小片段的DNA，使用PCR酶進(jìn)行酶切，并連接到T載體上，挑選陽性克隆，提交Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序，鑒定所得DNA片段是否含有一些特異性結(jié)合位點(diǎn)。

（3）鑒定蛋白與poly（dA）·poly（dT）和poly（dG）·poly（dC）序列的結(jié)合活性：提交Invitrogen公司合成單鏈poly（dA）、poly（dT）、poly（dG）、poly（dC）序列，各有22個(gè)堿基，在Tris緩沖液體系中，poly（dA）與poly（dT）、poly（dG）與poly（dC）在94℃條件下變性5 min，52℃退火連接10 min，復(fù)性成雙鏈poly（dA）·poly（dT）和poly（dG）·poly（dC）DNA片段。在緩沖體系終濃度為50 mmol/L Tris，150 mmol/L KCl下混合DNA與蛋白，25℃溫育30 min通過2倍DNA電泳膠低電壓30 V（防止過熱導(dǎo)致蛋白變性）電泳檢測(cè)蛋白與DNA是否具有結(jié)合活性。

（4）合成含有已知的HLH結(jié)構(gòu)域蛋白的DNA特異性結(jié)合框E-box（CANNTG）和N-box（CACNAG）的所有可能的序列片段，并在DNA兩端各加上8個(gè)AT堿基（保證具有超過20個(gè)堿基對(duì)，方便進(jìn)行下一步的凝膠滯留試驗(yàn)），外加對(duì)照組poly（dG）·poly（dC）片段，并如前面步驟復(fù)性成雙鏈DNA，所有序列如表1所示。

所有合成的DNA與蛋白在緩沖體系終濃度為50 mmol/L Tris，150 mmol/L KCl條件下按不同比例混合、25℃溫育30 min，各加入6×溴酚藍(lán)凝膠載樣緩沖液，然后上樣到8%非變性丙烯酰胺凝膠，在1×TBE染色液中穩(wěn)壓100 V 4℃低溫電泳，大約90 min后結(jié)束，收板，銀染顯色。根據(jù)是否出現(xiàn)DNA滯留片段判斷蛋白的DNA結(jié)合活性。

表 1 試驗(yàn)中用到的雙鏈DNA序列

2 結(jié)果

2.1 hASH4的人工合成及重組質(zhì)粒的鑒定

生物信息學(xué)分析所得的hASH4的bHLH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列為：

按大腸桿菌的密碼子優(yōu)化并加上NheI和XhoI酶切位點(diǎn)的基因序列為：

利用人工合成方法合成hASH4基因，將hASH4基因連接到pET28b質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)入E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性克隆送至Invitrogen公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的hASH4序列完全一致。

2.2 hASH4蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

用SDS-PAGE分析對(duì)比1.0 mmol/L IPTG條件下，在誘導(dǎo)溫度為18℃（12 h）、25℃（8 h）、37℃（4 h）中的誘導(dǎo)情況如圖 1所示。在37℃（4 h）誘導(dǎo)條件下，目的融合蛋白的可溶性表達(dá)量最高。目的融合

蛋白分子量約為9.1 kD，與圖中片段大小相符。 標(biāo)準(zhǔn)分子篩圖（圖 4），可以看出hASH4蛋白流出峰所在的緩沖液體積略大于溶菌酶，說明純化所得的蛋白分子量小于溶菌酶，且因?yàn)槿诤系鞍椎膯误w分子量為9.1 kD，所以該蛋白是以單體形式存在。由于在純化過程中沒有加入DTT、β-巰基乙醇等試劑來抑制二硫鍵的作用影響二聚體的形成，說明該蛋白在體內(nèi)也較難有同源二聚體的形成。這為下一步的DNA結(jié)合活性研究提供了一定的線索。

圖 1 不同溫度誘導(dǎo)hASH4蛋白表達(dá)的SDS-PAGE凝膠電泳圖

2.3 hASH4蛋白的純化

由于融合蛋白pET28b- hASH4含有His標(biāo)簽，可使用Ni-NTA親和柱純化表達(dá)產(chǎn)物，且融合蛋白PI值為9.73，所以選用弱陽性離子交換柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，所得融合蛋白經(jīng)過SDS-PAGE分析圖（圖 2）中可見得到一條約為10 kD左右的蛋白條帶，這與預(yù)期的蛋白分子量（9.1 kD）基本符合，且蛋白純度較高，基本無雜帶出現(xiàn)，并將所得蛋白用緩沖液透析，超濾至10 mg/mL，分裝并-80℃保存。

圖 2 純化過程所得蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖

2.4 hASH4蛋白存在形式的研究

通過分子篩試驗(yàn)確認(rèn)蛋白是否有二聚體形成，從分子篩流程圖（圖 3）中可以看出，蛋白流出峰只有一個(gè)，說明蛋白只以一種形式（只有一種分子大?。┐嬖?，對(duì)照實(shí)驗(yàn)室保存的溶菌酶（14 kD）的

圖 3 目的融合蛋白過分子篩流程圖

圖 4 溶菌酶（14 kD）的標(biāo)準(zhǔn)分子篩圖

2.5 部分與蛋白結(jié)合的DNA序列比對(duì)

經(jīng)過將純化時(shí)洗脫的DNA進(jìn)行克隆表達(dá)測(cè)序，得到一些小片段DNA的序列為：

（1）5'-TGTGCGAGCCAGCTCAAACTTTTTAACC TTTTTGTTTCAATTATGATCCAGGTACATTTCTGTGA TGTTGTCTGGGTGTTATTTTAAGGCCGCAGGTACCC CATAACCTTACAAGATCTGTGGTTTTACTAAAGGAC ACCCTATGAAAACCTCTA-3'。

（2）5'-TAGACCTCGCCAATACTGTTCAGCAGG ATGTGTCGCTGGCCCTGTTTAATTTCCTGGAGCATTT CCCGTTCTCTTCTGTGCTGTCATTCATTGCAATGGCG ATGGTCATCGTCTTCTA-3'。

（3）5'-TAGACCTCGCCAATACTGTTCAGCAGG ATGTGTCGCTGGCCCTGTTTAATTTCCTGGAGCATTT CCCGTTCTCTTCTGTGCTGTCATTCATTGCAATGGCG ATGGTCATCGTCTTCTA-3'。

（4）5'-TTTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAG TTTTTCTAAGAATTAATTCATGAGCGGATACATATT TGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTC CGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGT AAGCGTTAATATTTTGTTAAAAT-3'。

（5）5'-TCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTC ATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCC TTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGA GTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAA AGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACC GTCTATCAGGGCGA-3'。

（6）5'-TGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTA ACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGC TTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAA CAGGCAGACATA-3'。

（7）5'-TAGGAGCAGGAAACTGATGTACTGTTG ATTGGCGGCGGCATTATGAGCGCCACGTTGGGGAC CTATTTACGCGAGCTGGAGCCTGAATGGTCGATGAC CATGGTGGAGCGCCTGGAGGGTGTCGCGCAGGAGA GTTCGAACGGCTGGAA-3'。

如測(cè)序結(jié)果所示，經(jīng)過比對(duì)，只有4號(hào)片段中含有E-box（CANNTG）結(jié)合框，其沒有重復(fù)性高的DNA片段出現(xiàn)，所以猜測(cè)單體hASH4不一定具有特異性的DNA結(jié)合活性。所以下一步試驗(yàn)直接合成最特異性的片段poly（dA）·poly（dT）和poly（dG）·poly（dC），如果蛋白與這兩種DNA依然有結(jié)合，說明其具有一定的非特異性的結(jié)合活性。poly（dA）·poly（dT）和poly（dG）·poly（dC）在試驗(yàn)方法1.2.4所述的體系下與蛋白反應(yīng)，通過DNA凝膠電泳結(jié)果如圖 5所示，poly（dA）·poly（dT）序列和poly（dG）·poly（dC）序列與蛋白均有一定的結(jié)合活性，且poly（dG）·poly（dC）序列與蛋白的結(jié)合活性稍微強(qiáng)一些，所以猜測(cè)hASH4蛋白具有非特異性的DNA結(jié)合活性，而特異性則需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

從已有研究得知hASH4蛋白所屬的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的A組子家族，最常見的DNA結(jié)合框?yàn)镃AGCTG其次為CACCTG。在下一輪試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，第一步采用poly（dG）·poly（dC）片段o號(hào)、帶有N-box的k號(hào)片段、帶有最常見的CAGCTG框的h號(hào)片段與蛋白互作。在對(duì)比DNA與蛋白比為1∶1、1∶3、1∶6的不同組別非變性丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果（圖 6），發(fā)現(xiàn)在較高蛋白比6∶1時(shí)3個(gè)片段均出現(xiàn)相同的DNA片段滯后現(xiàn)象，在3∶1組中也有非常微量的滯后條帶，說明蛋白與3種片段存在相同的結(jié)合活性，且蛋白與DNA結(jié)合不是按照1∶1的比例進(jìn)行結(jié)合，如果為特異性結(jié)合，則一個(gè)蛋白能結(jié)合一個(gè)DNA雙鏈，說明蛋白與3種片段均為非特異性結(jié)合。

圖 5 蛋白與特異DNA互作的凝膠電泳圖

圖 6 雙鏈DNA與hASH4蛋白互作的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

第2步試驗(yàn)，減少DNA量加大蛋白比（1∶6、1∶9、1∶12），并使用含有A組子家族中最大可能的2個(gè)DNA特異結(jié)合框CAGCTG與CACCTG的h號(hào)片段和i號(hào)片段以及對(duì)照的poly（dG）·poly（dC）與蛋白互作，從圖 7中可以看出，3種DNA片段與蛋白均有結(jié)合存在，且結(jié)合活性沒有明顯不同。

第3步試驗(yàn)，使用所有合成的含有E-box

（CANNTG）以及N-box（CACNAG）DNA片段，在與蛋白比為1∶15的比例反應(yīng)，并通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從圖 8發(fā)現(xiàn)所有泳道均有DNA滯后片段出現(xiàn)，其滯后片段相同，證明所有片段與蛋白都具有相同的結(jié)合活性。

圖 7 雙鏈DNA與hASH4蛋白互作的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖 8 雙鏈DNA與hASH4蛋白互作的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖9 雙鏈DNA與BSA蛋白和hASH4蛋白互作的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

在前3步試驗(yàn)中，由于在非放射性凝膠滯留試驗(yàn)中高濃度蛋白有可能表現(xiàn)出“粘性”，繼而顯現(xiàn)出非特異性結(jié)合DNA的性質(zhì)，所以采用實(shí)驗(yàn)室保存的BSA溶菌酶蛋白以相同蛋白濃度并DNA蛋白比（1∶12、1∶15）作為對(duì)照組。從圖9中可以看出，BSA對(duì)照組（1號(hào)、2號(hào)條帶）中并沒有滯后的DNA片段出現(xiàn)，說明試驗(yàn)中DNA滯后的現(xiàn)象的確是跟hASH4蛋白結(jié)合引起的。結(jié)合前面的凝膠滯留試驗(yàn)結(jié)果，研究認(rèn)為hASH4蛋白單體并不存在有特異性的DNA結(jié)合活性，只具有非特異性結(jié)合活性。

3 討論

本研究中先期試驗(yàn)得到的與hASH4蛋白結(jié)合的DNA片段測(cè)序結(jié)果顯示并沒有存在已知的HLH轉(zhuǎn)錄因子家族所有特異性結(jié)合框，且發(fā)現(xiàn)蛋白與poly（dG）·poly（dC）和poly（dA）·poly（dT）這種非常特異的DNA都具有結(jié)合，固猜測(cè)其并沒有特異性結(jié)合DNA現(xiàn)象存在。所以在進(jìn)一步的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中就采用較為簡(jiǎn)單的DNA凝膠電泳和非放射性凝膠滯留試驗(yàn)來定性證明這一猜測(cè)。如果發(fā)現(xiàn)其存在著特異性的DNA結(jié)合活性，則需要放射性的EMSA試驗(yàn)來定性和定量證明蛋白特異性DNA結(jié)合活性的強(qiáng)弱，雖然也有研究直接通過非放射性的凝膠滯留試驗(yàn)驗(yàn)證蛋白的特異性的DNA結(jié)合活性，但我們認(rèn)為該試驗(yàn)方法并不嚴(yán)謹(jǐn)，可能只能定性地說明蛋白具有特異性結(jié)合活性，但并不能定量的證明［11，12］。

從試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)hASH4雖然屬于HLH轉(zhuǎn)錄因子家族A子家族，卻不具有特異性的DNA結(jié)合活性，且通過分子篩試驗(yàn)證明hASH4蛋白在體外以單體形式存在，不形成同源二聚體，這證明該蛋白在體內(nèi)一般也不會(huì)形成同源二聚體。所以猜測(cè)hASH4蛋白可能需先形成異源二聚體或多聚體才能進(jìn)一步特異性結(jié)合DNA而作用于下游基因并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，這種現(xiàn)象在HLH轉(zhuǎn)錄因子家族中普遍存在，如Max［13］、E47［14］蛋白家族等。要證明這個(gè)猜測(cè)則需要在進(jìn)一步研究進(jìn)行驗(yàn)證。由于hASH4蛋白于幼兒皮膚中大量表達(dá)存在，其功能應(yīng)該與皮膚發(fā)育有關(guān)，進(jìn)一步的研究可以嘗試找到已知的在皮膚分化發(fā)育中起到重要作用特別是也在幼兒皮膚大量表達(dá)的HLH轉(zhuǎn)錄因子或其他結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，與hASH4蛋白相互作用研究是否存在共同作用，若存在共同作用，則進(jìn)一步證明其復(fù)合物是否具有特異性的DNA結(jié)合活性。若無法找到也在皮膚中大量表

達(dá)的蛋白，則可以通過與已知的一些重要的HLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用，已有研究表明存在部分HLH轉(zhuǎn)錄因子在多個(gè)器官可以與不同的HLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合形成異源二聚體而發(fā)揮功能作用，若找到可以與hASH4蛋白相互作用的蛋白，可能會(huì)給其在體內(nèi)所起的功能和作用機(jī)制提供線索。

本研究采用的是原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)hASH4蛋白進(jìn)行表達(dá)純化，所得蛋白的翻譯后修飾狀態(tài)可能與細(xì)胞內(nèi)存在一定的不同，從而影響其與DNA的結(jié)合。在已有的對(duì)該家族同組別蛋白的研究中，多數(shù)均采用原核表達(dá)系統(tǒng)，例如MyoD、Max、E蛋白、PHO等蛋白家族［1，13-18］，通過原核表達(dá)報(bào)道了完整的蛋白晶體以及蛋白和DNA結(jié)合的晶體。本研究中hASH4蛋白能非特異性的結(jié)合DNA說明原核表達(dá)的hASH4蛋白具有預(yù)測(cè)性的DNA結(jié)合活性，只是這種非特異性結(jié)合DNA的性質(zhì)是否真正代表細(xì)胞內(nèi)該蛋白的特性還有待進(jìn)一步的研究和確認(rèn)。

通過原核表達(dá)得到的真核生物轉(zhuǎn)錄因子蛋白單體的低溶解度和不穩(wěn)定性導(dǎo)致其晶體結(jié)構(gòu)的不易獲取，所以對(duì)HLH蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析的研究大多集中于蛋白與DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)或蛋白二聚體與DNA的復(fù)合結(jié)構(gòu)，PDB數(shù)據(jù)庫上對(duì)HLH蛋白單體的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)較少，大部分為復(fù)合結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)［1，13，15-18］。因此在對(duì)HLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究中，其單體與DNA是否存在特異性結(jié)合活性是第一步需要得到驗(yàn)證的，本研究所采用的方法較為簡(jiǎn)單快捷，可以較好地在HLH轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)功能研究中得到推廣。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了hASH4的表達(dá)純化系統(tǒng)，通過 pET28b- hASH4 重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，原核表達(dá)得到可溶性融合蛋白，及電泳純化目的蛋白。hASH4蛋白單體不存在特異性的DNA結(jié)合活性，只存在非特異性結(jié)合活性。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression，Purification and DNA Binding Activity of Human Transcription Factor hASH4

Su Zhuolei Lou Tiantian Wang Yuandong Ji Chaoneng
（Institute of Genetics，School of Life Science，F(xiàn)udan University，Shanghai 200433）

hASH4 is a member of Helix-Loop-Helix（HLH）proteins which are an important group of transcription factors that exert such a determinative influence on a variety of cell proliferation, determination and differentiation from yeast to human. hASH4 has been reported closely related to skin differentiation and development, but the exact mechanism is unknown. In this study, the expression plasmid of pET28bhis- hASH4 was restructured and successfully expressed in BL21（DE3）. After the optimization of temperature, time, IPTG concentration of expression, we ascertain that 1mmol/L IPTG expressed 4 hours at 37℃ can get the best expression. and we got the electrophoretic purity of the target protein by Ni-NTA affinity chromatography and ion cation exchange chromatography. The non-radioactive EMSA experiment between DNA and protein showed that the hASH4 protein only has the non-sepcific DNA binding activity without specific DNA binding activity. The play of transcription factors by hASH4 in the body may be need to form a heterodimer or multimer to further specific binding to DNA and act on the downstream genes. This study provided clues for the really function in vivo of hASH4 and laid the foundation for the further crystallization conditions screening, structural analysis and functional studies.

HLH bHLH hASH4 DNA-binding Specific binding Non-specific binding

2014-04-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30770427），“973”課題（2009CB825505）

蘇琢磊，男，碩士研究生，研究方向：分子遺傳與結(jié)構(gòu)生物學(xué)；E-mail：suzhuolei@gmail.com

季朝能，男，博士，教授，研究方向：分子遺傳與結(jié)構(gòu)生物學(xué)；E-mail：chnji@fudan.edu.cn