周才碧，張敏星，蔣陳凱，黃亞輝，陳文品

(華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院茶葉科學系，廣東 廣州 510642)

黑曲霉作為曲霉屬一種重要的微生物［1］，在生長繁殖過程中微生物分泌的胞外酶為普洱茶中酚類物質(zhì)的氧化、纖維素和果膠的分解、蛋白質(zhì)的降解提供了有效的生化動力，使與茶葉品質(zhì)形成相關的理化成分發(fā)生了復雜的變化，對普洱茶品質(zhì)風味形成起著很大的作用［2-3］。

1 黑曲霉生產(chǎn)酶類

在普洱茶渥堆過程，產(chǎn)生了多酚氧化酶、果膠酶和纖維素酶等酶類，多酚氧化酶、纖維素酶和果膠酶活性與真菌類數(shù)量變化(主要是酵母菌和霉菌)存在顯著相關，酸性蛋白酶僅與真菌類的黑曲霉有較強的關聯(lián)度［4］。

1.1 多酚氧化酶

在不同普洱茶渥堆過程中，多酚氧化酶的活性呈現(xiàn)從一翻到二翻上升，到三翻緩慢下降的趨勢［5］，普洱茶經(jīng)外源多酚氧化酶，茶多酚、氨基酸和茶黃素等的總量有不同程度的極顯著下降趨勢，而茶褐素總量則有極顯著上升趨勢，除烷烴類化合物外，茶樣香氣物質(zhì)種類顯著降低［6］。

1.2 單寧酶

Wang Fang等［7］以茶梗為原料，接種黑曲霉，在固態(tài)發(fā)酵下控制工藝條件可以生產(chǎn)單寧。HA Aboubakr等［8］發(fā)現(xiàn)黑曲霉產(chǎn)單寧酶能力受到發(fā)酵工藝、底物種類、糖源、氮源、二價陽離子等影響。以黑曲霉制備單寧酶，糖基含量43%，一般糖基為葡萄糖和甘露糖［9］，發(fā)酵72 h，單寧酶的活力較高［10］。普洱茶經(jīng)單寧酶、多酚氧化酶和多糖水解酶類等制成的復合酶制劑處理，在一定濃度下有利于普洱茶中水浸出物、茶多酚、可溶性糖的增加，有助于普洱茶品質(zhì)的形成，并可縮短渥堆發(fā)酵時間［11］。

1.3 果膠酶

黑曲霉可作為果膠酶的產(chǎn)酶菌株，其果膠甲基酯酶可在畢赤酵母中高效表達［12］。在普洱茶渥堆過程中，果膠酶和纖維素酶的酶活性呈先增后減的變化趨勢［13］。進行誘變處理，獲取果膠酶高產(chǎn)突變菌株，優(yōu)化培養(yǎng)，酶活力達到2290 U/g以上，比出發(fā)菌株提高4.3倍［14］。而且在黑曲霉發(fā)酵過程中引入酒精酵母，構建成混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶的體系，可以明顯降低底物抑制效應，提高黑曲霉產(chǎn)果膠酶的能力［15］。

1.4 纖維素酶

纖維素酶和果膠酶是內(nèi)源酶，在普洱茶發(fā)酵過程中其活性變化趨勢相似，二翻達到高峰。以黑曲霉為發(fā)酵菌株，通過初篩、復篩篩選出了纖維素酶活力提高的菌株，采用液體發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶，產(chǎn)酶體系相對比較穩(wěn)定［16］。而且，利用綠色木霉和黑曲霉進行混合菌種固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，可以明顯提高產(chǎn)酶量［17］，而黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶可提高綠茶廢棄物中營養(yǎng)和功能成分的提取率［18］。

1.5 其他酶類

黑曲霉還可以產(chǎn)生脂肪酶［19］、蛋白酶［20］、木聚糖酶［21］和葡萄糖氧化酶［22］等，通過誘導突變或氨基酸殘基取代等方式，對黑曲霉進行改造，得到相關酶的突變體，篩選出黑曲霉高產(chǎn)酶菌株［23］。

2 黑曲霉與普洱茶的關系

在發(fā)酵過程中，微生物分泌的胞外酶為茶葉中酚類物質(zhì)的氧化、纖維素和果膠的分解、蛋白質(zhì)的降解提供了有效的生化動力，使與茶葉品質(zhì)形成相關的理化成分發(fā)生了復雜的變化［24］，改變茶葉的感官特性［25］，有效地縮短加工時間，提高普洱茶品質(zhì)［26］。

2.1 普洱茶中的黑曲霉

普洱茶發(fā)酵的主要優(yōu)勢微生物［27］有酵母菌、黑曲霉、紅曲霉、米曲霉、青霉和灰綠曲霉［28］等，而黑曲霉始終以優(yōu)勢菌群存在［29］。普洱茶渥堆初期，茶胚中霉菌數(shù)量大量增長，主要以黑曲霉為主，隨后數(shù)量趨于穩(wěn)定，變化不明顯［2］。

2.2 黑曲霉與普洱茶品質(zhì)的關系

在微生物分泌胞外酶的酶促作用協(xié)同下，發(fā)生一系列復雜的化學變化，影響普洱茶中茶多酚、咖啡堿和氨基酸等內(nèi)含物的含量［30-31］。至渥堆結(jié)束，茶坯的茶多酚、兒茶素、茶黃素、茶紅素、氨基酸的含量均呈減少趨勢，水溶性糖、茶褐素、咖啡堿的含量則呈增加趨勢［32］。

2.2.1 滋味方面 黑曲霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的20多種水解酶，不同酶處理茶多酚和兒茶素含量均下降，茶黃素、茶褐素和咖啡堿含量均增加，茶紅素呈波動趨勢［33］，使茶湯中的收斂性和苦澀味明顯降低，產(chǎn)生一系列具有鮮爽、回甘味的特色物質(zhì)［34］。而且隨著渥堆時間的延長，茶多糖和水溶性果膠等含量總體上不斷增加［35］，水浸出物含量的高低直接影響普洱茶的品質(zhì)，并與普洱茶的湯色、濃度、滋味密切相關［36］。相關研究表明，外源糖處理茶樣，可溶性氨基酸和茶樣的酚糖比含量顯著降低，通過美拉德反應改善茶葉品質(zhì)［37］。

2.2.2 湯色方面 接入黑曲霉的普洱茶在發(fā)酵過程中，通過有機溶劑萃取得到茶褐素［38］，而且茶多酚含量和茶色素含量的變化較顯著，茶湯色由黃綠色變?yōu)榧t棕色［39］。將篩選出的根霉、青霉和黑曲霉按1∶1∶1制得的發(fā)酵劑用于普洱茶發(fā)酵，取得了較好的發(fā)酵效果。茶多酚、兒茶素、氨基酸、茶黃素、茶紅素總量有不同程度的極顯著下降趨勢，茶褐素總量則極顯著上升趨勢［40］;而且各次翻堆茶樣在湯色、香氣、滋味和葉底等方面都較好［41］。

2.2.3 香氣方面 黑曲霉在普洱茶香氣前體物質(zhì)的降解過程中發(fā)揮關鍵作用［42］，普洱茶一般以具有霉味和陳香的甲氧基苯類為主［43］，甲氧基苯類化合物是影響熟普洱茶香氣的重要因子［44］。主要有 1，2，3-三甲氧基苯、1，2-二甲氧基苯和 1，2，4-三甲氧基苯等香氣成分［45］，而 1，2，3-三甲氧基苯是甲氧基苯類中含量最豐富的成分，在渥堆結(jié)束后含量達到最高［46］。黑曲霉固態(tài)發(fā)酵共分離鑒定出18種化合物，占總檢測量的74.77%［47］，而通過黑曲霉發(fā)酵的普洱茶滋味醇厚，陳香透花果香。

2.2.4 其他方面曲霉屬真菌的種類及組合對普洱茶的茶多酚組成與含量，以及沒食子酸、茶氨酸、咖啡因等特征成分的含量均有顯著的影響［25］。曲霉、青霉和散囊菌在茶葉真菌發(fā)酵過程中，能夠產(chǎn)生抑制食品致病菌和腐敗菌的代謝物質(zhì)［48］。

3 展望

黑曲霉作為普洱茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株之一，在生長繁殖過程中能產(chǎn)生多種高活性的酶系。目前，雖然國內(nèi)外對于黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生酶類的研究取得了巨大進展，但是所產(chǎn)酶類與普洱茶品質(zhì)關系不夠明確，具體的作用機理還有待于深入研究。

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