李晰，辛世杰，王磊，宋澤，荊玉辰，曹輝，段志泉，張健

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外教研室血管甲狀腺外科，沈陽110001）

·技術(shù)方法·

氯化鈷模擬法構(gòu)建骨骼肌細胞缺氧模型

李晰，辛世杰，王磊，宋澤，荊玉辰，曹輝，段志泉，張健

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外教研室血管甲狀腺外科，沈陽110001）

目的觀察CoCl2對體外培養(yǎng)的原代骨骼肌細胞的影響，探討合理的體外化學(xué)模擬低氧模式。方法利用組織貼塊法培養(yǎng)并鑒定原代骨骼肌細胞，給予CoCl2處理，觀察不同時間和濃度細胞凋亡情況，以及通過免疫印跡及實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、BAX的表達變化情況。結(jié)果與對照組比較，CoCl2處理組的細胞存活率明顯下降（P＜0.05），凋亡率明顯增加（P＜0.05），且骨骼肌細胞存活率下降程度及細胞凋亡率增加程度均隨著氯化鈷濃度增加時間延長而升高。HIF-1α、BAX蛋白水平亦隨CoCl2濃度升高和時間延長而增加。結(jié)論CoCl2對原代骨骼肌細胞的增殖凋亡及相關(guān)基因的表達成呈時間和濃度依賴性，成功建立起一種體外培養(yǎng)原代骨骼肌細胞缺氧誘導(dǎo)模型，可以作為體外研究骨骼肌缺血缺氧的良好模型。

氯化鈷；骨骼肌細胞；凋亡；低氧誘導(dǎo)因子1α

下肢動脈閉塞癥是常見的下肢動脈閉塞性疾病，由于下肢缺血時動脈血流減少、組織因缺血等發(fā)生不可逆性損傷。細胞壞死、萎縮和間質(zhì)纖維化等導(dǎo)致骨骼肌損傷。目前對這種肌肉缺血性變化尚無良好的治療方法。缺血與缺氧常常是相互伴隨的，各種研究表明顯示，在哺乳系統(tǒng)中，二氯化鈷是已經(jīng)被廣泛應(yīng)用的模擬缺氧環(huán)境的化學(xué)試劑，能夠產(chǎn)生與缺氧缺血相似的反應(yīng)［1］。因此，為了進一步探討骨骼肌在缺血缺氧過程中變化機制，我們利用原代骨骼肌細胞在二氯化鈷不同濃度和處理時間情況下研究細胞的增殖、活力、凋亡及缺氧相關(guān)反應(yīng)基因的變化，以便建立一個可靠、重復(fù)性高、檢測方便的骨骼肌缺氧誘導(dǎo)模型，為探索及防治下肢動脈硬化閉塞癥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2～3 d新生SD大鼠，雌雄不限（中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（HyClone，美國）；α橫紋肌肌動蛋白、TRITC標記的山羊抗兔IgG（博奧森，中國）；低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）抗體、BAX抗體、GAPDH抗體（Santa Cruz公司，美國）；Real-time PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）；CoCl2、MTT、二甲基亞砜（Sigma，美國）。

1.2 方法

1.2.1 原代骨骼肌細胞培養(yǎng)：應(yīng)用原代細胞培養(yǎng)方法，2～3 d新生SD大鼠通過機械剝離骨骼肌。骨骼肌剪碎成許多小片，放置于含10%胎牛血清的DMEM，使其貼在培養(yǎng)瓶表面。肌細胞從肌組織爬出，幾天后相互融合。原代細胞應(yīng)用含EDTA的胰酶消化傳代。以5×104密度將細胞接種于培養(yǎng)皿，給予氯化鈷不同濃度（0、50、100、200、400 μmol/L）和不同時間（0、4、8、12、24 h）處理。

1.2.2 細胞免疫熒光鑒定：免疫熒光染色在以每孔104個細胞密度接種于24孔板。細胞經(jīng)PBS清洗甲醇固定，5%BSA封閉，兔抗橫紋肌肌動蛋白（1∶200）和TRITC標記的山羊抗兔IgG（1∶100）。細胞核用Hoechst 33258染色，成像使用激光共聚焦顯微鏡（FV1000S-SIM/IX81，Olympus）。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)：按照日本TaKaRa公司說明書，采用Trizol處理剪碎的組織并提取總RNA，根據(jù)日本TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用日本TaKaRa RR420A試劑盒來研究HIF-1α的表達，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)，HIF-1α上游引物為5′-TTGAAGATGTCCCGTTGTA-3′；下游引物為5′-GTGACTCTGGGCTTGACTCTA-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′；下游引物為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCA-3′。超純水代替cDNA作為對照。PCR產(chǎn)物的質(zhì)量監(jiān)控PCR擴增后的熔融曲線分析。目的基因的表達量通過2-ΔCt方法進行統(tǒng)計。

1.2.4 免疫印跡：細胞在裂解液中充分裂解，于冰上靜止15 min后12 000g離心30 min。蛋白含量通過紫外分光光度計檢測（UV3103 PYE UNICAM），每個樣本上樣量40 μg，配置10%聚丙烯酰胺凝膠，煮樣后電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉1 h，HIF-1α一抗（1∶100）、BAX一抗（1∶200）、GAPDH為內(nèi)參（1∶1000），4℃孵育過夜。洗膜后，以二抗（1∶5 000）室溫孵育，清洗后ECL發(fā)光，應(yīng)用Quantity One軟件計算光密度值。

1.2.5 MTT檢測：MTT 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，Sigma，美國）來檢測二氯化鈷（Sigma，美國）處理的肌細胞。細胞經(jīng)過0.05%的胰蛋白酶消化并計數(shù)，以每孔100 μL 5 000個細胞鋪至96孔板中過夜。細胞給予氯化鈷不同濃度（0、50、100、200、400 μmol/L）和不同時間（0 h、4 h、8 h、12 h、24 h），加入20 μL MTT（每毫升5 mg溶于PBS）于37℃培養(yǎng)4 h。隨后除去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL二甲基亞砜10 min，使結(jié)晶物溶解。酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長570 nm）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 原代骨骼肌細胞的培養(yǎng)及鑒定

倒置顯微鏡下觀察原代骨骼肌細胞，培養(yǎng)3～4 d后開始有細胞逐漸爬出，隨后開始增生，細胞逐漸延展成梭形（圖1A）。細胞逐漸增多并相互融合，按一定方向呈有序排列（圖1B）。我們利用橫紋肌肌動蛋白進行免疫熒光染色，胞質(zhì)染成紅色，表明培養(yǎng)的為骨骼肌細胞（圖1C）。

圖1 原代骨骼肌細胞的培養(yǎng)Fig.1 Primary culture of primary skeletal muscle cell

2.2 氯化鈷對原代骨骼肌細胞存活及凋亡的影響

MTT結(jié)果顯示，終濃度為200 μmol/L CoCl2培養(yǎng)不同時間后，骨骼肌細胞存活率隨著時間延長而降低；在不同濃度處理后，骨骼肌細胞的凋亡率也隨著濃度的增加而增加。同樣，免疫印跡發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白BAX也具有相同的趨勢（圖2，P＜0.05）。

圖2 經(jīng)氯化鈷處理的骨骼肌細胞活力Fig.2Cell viability of skeletal muscle cell subjected to CoCl2treatment

2.3 氯化鈷對原代骨骼肌細胞HIF-1α的影響

經(jīng)200 μmol/L CoCl2處理0、4、8、12和24 h，發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因和蛋白水平上逐漸升高；同樣地，HIF-1 α基因和蛋白表達增高與CoCl2濃度正相關(guān)（圖3、4，P＜0.05）。

圖3 氯化鈷對HIF?1a和BAX蛋白表達的影響Fig.3Effect of CoCl2on HIF?1a and BAX protein expression

圖4 氯化鈷對HIF?1αmRNA表達的影響Fig.4Effect of CoCl2onHIF?1αmRNA expression

3 討論

目前國內(nèi)各實驗室廣泛使用簡易密封艙模擬缺氧模型，不足之處是不能控制缺氧程度，不便于觀察氧分壓，而且不便于控制溫度，通入的氣體未經(jīng)過濾，有污染的危險性。氯化鉆模擬缺氧是國際上比較常用的模擬缺氧的方法，鈷離子能競爭氧感受器—血紅蛋白卟啉環(huán)中的鐵離子，抑制氧合血紅蛋白的形成而喪失與O2結(jié)合的能力，誘發(fā)一系列類似缺氧反應(yīng)，從而模擬缺氧狀態(tài)［2］。有研究表明經(jīng)過氯化鈷處理后而引起的一系列基因變化與缺氧微環(huán)境的影響是相似的，可能是經(jīng)過相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控，包括一些基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，如HIF-1α、p53、p21和PCNA。而目前已經(jīng)證實在維持氧平衡的調(diào)節(jié)中，HIF-1α是一個主要的調(diào)節(jié)因子，能在基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)細胞對缺氧的適應(yīng)性［3］。

本研究觀察氯化鈷對原代培養(yǎng)骨骼肌細胞凋亡的影響及HIF-1α的表達變化，結(jié)果顯示與對照組比較，經(jīng)CoCl2處理的細胞存活率明顯下降（P＜0.05），凋亡率明顯增加（P＜0.05），且肌細胞存活率下降程度及細胞凋亡率增加程度均隨CoCl2濃度增加和時間延長而逐漸升高，免疫印跡顯示促凋亡蛋白BAX具有逐漸升高的趨勢反映CoCl2對骨骼肌細胞凋亡作用。有趣的是，HIF-1α基因和蛋白水平亦隨CoCl2濃度升高和時間延長而增加。盡管CoCl2介導(dǎo)HIF-1α蛋白穩(wěn)定的機制還沒有完全闡明，但普遍認為氯化鈷是HIF-1α的非缺氧激活的一種方式，其一機制是金屬鈷離子取代脯氨酸羥化酶催化中心的亞鐵離子，抑制脯氨酸殘基的羥化作用，同時氯化鈷影響抑癌基因產(chǎn)物pVHL而抑制pVHL與HIF-1 α之間的相互作用［4］，二種機制均是使HIF-lα不被泛素化及其在蛋白酶體中的降解而變得穩(wěn)定，表達因而增加。

而凋亡的發(fā)生主要是由內(nèi)在（線粒體）通路引起線粒體膜高通透性，不僅是線粒體呼吸鏈活性的喪失，導(dǎo)致細胞色素C釋放而誘導(dǎo)凋亡［5］。本實驗同樣證實以往研究，氯化鈷誘導(dǎo)缺氧與多種細胞增殖和凋亡密切相關(guān)，以及凋亡相關(guān)因子表達的顯著變化。HIF-1α為缺氧應(yīng)答的全局性調(diào)控因子，在缺氧誘導(dǎo)的哺乳動物細胞中廣泛表達，對缺氧具有特異感受性，參與體內(nèi)許多缺氧反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，在低氧性介導(dǎo)的細胞凋亡中有著重要的作用。然而，HIF-1α是否刺激細胞凋亡或抗凋亡，這一結(jié)論還不清楚。不同的研究得出不同結(jié)論［6～8］。一些數(shù)據(jù)顯示過表達HIF-1α能夠顯著抑制Mdm2阻止泛素化穩(wěn)定p53進而促進凋亡［8］。相反的，關(guān)于HIF-1α抗凋亡的作用，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)過表達HIF-1α能夠降低缺氧所引起的細胞凋亡，在低氧應(yīng)激中發(fā)揮抗凋亡蛋白的作用［10］。因此HIF-1α與凋亡之間相互作用仍需要進一步研究，但我們可以肯定的是，HIF-1α在缺氧組織發(fā)生凋亡失調(diào)中發(fā)揮重要作用，

總之，CoCl2化學(xué)模擬低氧過程中伴隨著對細胞增殖和凋亡的復(fù)雜影響，也影響缺氧主要調(diào)節(jié)因子HIF-1α蛋白水平，因此以氯化鈷用于構(gòu)建模擬原代骨骼肌細胞缺氧誘導(dǎo)模型是可行的。

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（編輯裘孝琦）

Construction ofa New Modelfor SkeletalMuscle CellHypoxia Using Cobalt Chloride

LIXi，XINShi-jie，WANGLei，SONGZe，JINGYu-chen，CAO Hui，DUANZhi-quan，ZHANGJian
（DepartmentofVascularand Thyroid Surgery，GeneralSurgery Department，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effect of cobalt chloride on primary cultured skeletal muscle cells and explore the reasonable strategy of simulation chemical hypoxia by using CoCl2.MethodsPrimary skeletal muscle cells were isolated and cultured via tissue explants adhesion method，and identified by immunofluorescence assay.Cells were then incubated with different concentration of cobalt chloride for different time length，and the cellapoptosiswas detected respectively.Immunoblotting and qRT-PCR were used to determine the mRNA and protein levels ofHIF-1α and BAX.ResultsCompared with control group，cell survival rate was significantly decreased（P＜0.05），and apoptotic rate was markedly increased in cells treated with CoCl2（P＜0.05）.Moreover，the effects were positively correlated with the increasing concentration and exposure time of CoCl2.ConclusionEffect of CoCl2on the primary skeletal muscle cells proliferation and apoptosis is dose and time-dependent.An in vitro hypoxia model ofskeletalmuscle cellwassuccessfully established，which could be a good modelforinvestigating ischemia/hypoxia on skeletalmuscle cells.

cobalt chloride；skeletal muscle cell；apoptosis；hypoxia inducible factor 1α

R654.3

A

0258-4646（2014）03-0265-04

國家自然科學(xué)基金（81170295）

李晰（1986-），男，博士研究生.

辛世杰，E-mail：sjxin@mail.cmu.edu.cn

2013-12-12

網(wǎng)絡(luò)出版時間：