關(guān)舒，曹彧，王玉穎，陳思，毛曉韻，陳波，姚凡，吳云飛，李繼光，金鋒

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科，沈陽 110001）

乳腺癌是中國東北地區(qū)女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多因素、多突變積累過程。p53作為重要的腫瘤抑癌基因，參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞分化及凋亡等重要生物學(xué)行為。最近研究顯示p53基因第4外顯子第72位密碼子多態(tài)性（p53 Arg72Pro；G→C改變導(dǎo)致精氨酸（Arg）被脯氨酸（Pro）取代）與多種腫瘤遺傳易感性密切相關(guān)［1，2］。鼠雙微基因（Mouse double minute 2，MDM2）作為細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)p53蛋白濃度及活性最為關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控因子，與p53構(gòu)成負(fù)反饋環(huán)路，抑制其轉(zhuǎn)錄活性；同時(shí)MDM2借助其E3泛素連接酶活性，導(dǎo)致p53蛋白降解，從而減弱p53對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控作用［3，4］。最近研究發(fā)現(xiàn)MDM2內(nèi)含子區(qū)內(nèi)的p53反應(yīng)啟動(dòng)子區(qū)存在功能性單核苷酸多態(tài)性（SNPT309G）可顯著增加MDM2與轉(zhuǎn)錄因子Spl親和力，使MDM2蛋白表達(dá)水平增高，減弱p53信號(hào)通路的傳導(dǎo)功能［5］。由此可見，抑癌基因p53和其負(fù)性調(diào)控基因MDM2在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。因此，本研究采用病例對(duì)照研究分析p53 Arg72Pro和MDM2 T309G多態(tài)性與中國東北人群乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科2006年10月至2008年6月女性乳腺癌305例，年齡22~85歲，中位年齡50.1歲?；颊卟±斫?jīng)2位病理醫(yī)生按世界衛(wèi)生組織（WHO）《乳腺病理組織學(xué)分類》（2003新版）標(biāo)準(zhǔn)讀片確認(rèn)其病理類型，其中浸潤性導(dǎo)管癌262例（85.9%）；浸潤性小葉癌10例（3.3%）；其他類型癌33例（10.8%）。其中臨床分期Ⅰ~Ⅱ期占83.9%（256例）、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者占37%（113例），其中ER陽性181例（59.3%），ER陰性124例（40.7%）。對(duì)照組為中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科2006年10月至2008年6月女性良性乳腺病變345例（病理類型為乳腺?。挲g24~87歲，中位年齡48.7歲。

1.2 DNA提取

抽取以上病例空腹外周靜脈血樣本約5 mL，置于EDTA抗凝管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用酚氯仿法提取全血樣本的基因組DNA，用NanoDrop 1000紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸質(zhì)量及濃度，并全部標(biāo)準(zhǔn)化為10 ng/μL。

1.3 SNP檢測(cè)

應(yīng)用Real?time PCR方法檢測(cè)。p53 Arg72Pro（rs1042522）的TaqMan探針標(biāo)識(shí)序列為：TCCCAGAATGCCAGAGGCTGC TCCCC［C/G］CGTG GCCCCTGCACCAGCAGCTCCT；其中VIC標(biāo)記位點(diǎn)中的C基因型，F(xiàn)AM標(biāo)記位點(diǎn)中的G基因型。MDM2 T309G（rs2279744）的TaqMan探針標(biāo)識(shí)序列為 GCATCACTCCACTTTCCCCCTAACTA［C/T］TAT CAATTTCCTCCATGATCCAAAA；將配制好的20μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃/30 s，之后95℃/5 s→60℃/20 s循環(huán)45次，每次循環(huán)末尾采集FAM和HEX（與VIC通道相同）通道信號(hào)。待反應(yīng)結(jié)束后通過Mxpro2.0軟件保存并分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件包SPSS16.0計(jì)算。采用χ2檢驗(yàn)確定基因型頻率是否符合Hardy?Weinberg平衡，比較基因型的組間分布頻率，分析不同基因型與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。采用非條件Logistic回歸分析計(jì)算比值比（odds ratios，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI），分析不同基因型與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)和臨床病理特征之間的相關(guān)性，并排除年齡和絕經(jīng)狀況等混雜因素的影響。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p53 Arg72Pro和MDM2 T309G多態(tài)性及Hardy?Weinberg平衡檢驗(yàn)（表1）

表1 p53 Arg72Pro、MDM2 T309G基因型分布頻率及與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性Tab.1 The frequency distribution of p53 Arg72Pro、MDM2 T309G genotype and their association with breast cancer risk

在病例組及對(duì)照組人群中，p53 Arg72Pro和MDM2 T309G各基因型分布頻率均符合Hardy?Weinberg平衡。p53 Arg72Pro GC、GG及GC/GG基因型與CC基因型相比可顯著提高乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（GC vs CC：P=0.037，OR=1.488，95%CI：1.023~2.164；GCvs CC：P<0.001，OR=2.747，95%CI：1.760~4.286；GC/GG vs CC：P=0.001，OR=1.811，95%CI：1.272~2.576），見表1。MDM2 T309GTT基因型亦與乳腺癌易感性密切相關(guān)（P=0.007，OR=1.833，95%CI：1.181~2.846）、即攜帶MDM2 T309GT等位基因的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)大（Tvs G：P=0.013，OR=1.323，95%CI：1.061~1.649）。

2.2 p53 Arg72Pro和MDM2 T309G基因型頻率與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

p53 Arg72Pro的多態(tài)性與乳腺癌病理類型相關(guān)，浸潤性小葉癌患者攜帶p53 Arg72Pro GC+GG基因型中的比率（40.0%）明顯低于浸潤性導(dǎo)管癌的患者（80.5%）（P=0.007）。ER陽性乳腺癌患者攜帶MDM2 T309GTG+TT基因型的比率（62.4%）明顯低于ER陰性乳腺癌患者（76.6%）（P=0.009）。此外，我們并未發(fā)現(xiàn)p53 Arg72Pro和MDM2 T309G不同基因型與患者的年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及PR、HER2狀態(tài)在分布頻率上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見表2。

3 討論

乳腺癌發(fā)生的原因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚，一般認(rèn)為受環(huán)境因素和遺傳因素共同作用。p53蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)節(jié)下游一系列靶基因表達(dá)對(duì)DNA損傷等做出反應(yīng)。MDM2作為下游靶基因之一，對(duì)p53通路發(fā)揮關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控作用。最近研究證實(shí)癌基因MDM2或抑癌基因p53的功能獲得或缺失都有可能導(dǎo)致乳腺細(xì)胞的異常生長，甚至癌變的發(fā)生。一些國外相關(guān)研究［1，2，6，12］表明，p53 Arg72Pro和MDM2 T309G多態(tài)性與乳腺癌的易感性密切相關(guān)，因此本研究分析了p53 Arg72Pro和MDM2 T309G多態(tài)性與中國東北地區(qū)人群乳腺癌易感性及相關(guān)臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。

表2 p53 Arg72Pro、MDM2 T309G基因型分布頻率與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Tab.2 Correlations of p53 Arg72Pro、MDM2 T309G genotypes with clinicopathological parameters in patients with breast cancer

本病例對(duì)照研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p53 Arg72Pro多態(tài)性中，與CC基因型相比，GG基因型能夠增加2.7倍的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而GC基因型能夠增加1.5倍發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，病例組與對(duì)照組的GG基因型頻率分別為17.1%和30.5%。等位基因G增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)1.66倍。由于環(huán)境暴露及遺傳背景上的差異，基因多態(tài)性對(duì)于不同人群乳腺癌易感性的影響可能并不相同。國內(nèi)外關(guān)于p53 Arg72Pro多態(tài)性與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究得出了有爭議的結(jié)論。Damin等［1］對(duì)巴西人群以及Gochhait等［2］對(duì)印度人群的研究均與本研究結(jié)果一致，認(rèn)為G等位基因?yàn)槿橄侔┌l(fā)病的危險(xiǎn)因素。然而，Akkiprik等［6］對(duì)土耳其人群的研究報(bào)道提示C等位基因?yàn)槿橄侔┑娘L(fēng)險(xiǎn)基因。Hou等［7］進(jìn)行的一項(xiàng)Meta分析顯示，p53 Arg72Pro多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯相關(guān)性。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，GC+GG基因型中浸潤性導(dǎo)管癌的比率比CC基因型高，CC基因型中浸潤性小葉癌比率明顯增高。這與Tommiska等［8］研究結(jié)果一致。如此可見，若要明確p53多態(tài)性與乳腺癌的確切關(guān)系，尚需要進(jìn)一步闡明多態(tài)性位點(diǎn)的功能以及進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來進(jìn)行不同腫瘤間及不同人群中的多個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性的研究。

本研究關(guān)于MDM2 T309G多態(tài)性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與GG基因型相比，TT基因型能夠增加1.83倍的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，等位基因T增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)1.32倍。目前國內(nèi)外關(guān)于MDM2 T309G與乳腺癌易感性研究的結(jié)果并不一致。Lum等［9］研究發(fā)現(xiàn)上海人群中MDM2 T309G與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)；而另外一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的歐洲人群及非洲裔人群中，并未發(fā)現(xiàn)MDM2 T309G與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［10］；吳燦等［11］研究并未發(fā)現(xiàn)MDM2 T309G與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，但進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后人群攜帶T/G型或G/G型可使乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高1.8倍。最近臺(tái)灣地區(qū)的研究顯示，MDM2 T309GG/G及T/G型與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)［12］；可見，MDM2 T309G與女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系的結(jié)論并不一致，可能與p53、MDM2形成的反饋調(diào)節(jié)通路的復(fù)雜性相關(guān)，具體內(nèi)在作用機(jī)制仍需探討，另外本研究結(jié)果是基于中國北方女性人群，應(yīng)在其他人群或其他腫瘤類型中進(jìn)一步證實(shí)。綜上所述，p53 Arg72Pro和MDM2 T309G為中國人重要的乳腺癌遺傳易感候選分子，可作為乳腺癌高危人群的篩選指標(biāo)之一。

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