趙琪，趙江月，張勁松

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院眼科，遼寧大連116023；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽(yáng)110032）

骨形成蛋白受體ⅠA在晶狀體內(nèi)條件敲除后對(duì)胚眼晶狀體發(fā)育的影響

趙琪1，趙江月2，張勁松2

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院眼科，遼寧大連116023；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽(yáng)110032）

目的通過(guò)研究骨形成蛋白受體ⅠA（BMPRⅠA）基因在晶體內(nèi)條件敲除小鼠中的作用，闡述胚胎發(fā)育過(guò)程中BMPRⅠA在胚眼晶狀體發(fā)育中產(chǎn)生的影響。方法采用BMPRⅠA基因在晶體內(nèi)條件敲除的小鼠alk3fl/fl；lecre和alk3fl/+；lecre，母鼠alk3fl/fl配公鼠lecre alk3fl/+或者母鼠alk3fl/+配公鼠lecre alk3fl/fl產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)組lecre alk3fl/fl（3只），對(duì)照組為lecre alk3fl/+（3只）。提取鼠尾DNA，然后進(jìn)行基因型鑒定，取胚胎固定，石蠟包埋，HE染色。接下來(lái)進(jìn)行免疫熒光檢查，一抗是sc-9305 bmp7，二抗是IF-0314 aG0IgG/FITC，熒光鏡下觀察。結(jié)果BMPRⅠA晶體內(nèi)條件敲除的小鼠與對(duì)照組比較，晶體的形態(tài)學(xué)變化差異從E13.5 d開(kāi)始可以分辨，在E15.5 d已經(jīng)有顯著差異，但實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有晶體的發(fā)育。在BMPRⅠA晶體內(nèi)條件敲除的小鼠中，骨形成蛋白7（BMP7）在晶體內(nèi)的表達(dá)顯著減少，尤其在胚胎發(fā)育的中后期（E13.5 d～E15.5 d）；而對(duì)照組中BMP7的表達(dá)不受影響。結(jié)論BMPRⅠA在晶體的發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用，其在晶體內(nèi)條件敲除可以導(dǎo)致晶體發(fā)育不良，但不會(huì)導(dǎo)致晶體的缺失。BMP7在胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)于晶體中，而且其表達(dá)受BMPRⅠA的影響。

骨形成蛋白受體ⅠA；骨形成蛋白7；晶狀體；胚胎發(fā)育

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）家族成員之一，除了在骨和軟骨的發(fā)育及誘導(dǎo)異位骨和軟骨發(fā)生的過(guò)程中具有重要作用外，還有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)作用［1］，BMP幾乎在所有發(fā)育中的組織和器官的分化和形成中起關(guān)鍵作用。眼組織源于神經(jīng)外胚葉、表皮外胚葉和中胚葉，發(fā)育過(guò)程復(fù)雜，并存在各組織間的相互作用，多種BMP成員及相應(yīng)細(xì)胞因子參與其發(fā)育。在BMP傳遞信號(hào)路徑中，其發(fā)揮功能要通過(guò)結(jié)合跨膜絲氨酸蘇氨酸激酶受體實(shí)現(xiàn)［2］。BMP有兩種受體，受體Ⅰ和受體Ⅱ，都是二聚體（是相同的二分子二聚體），具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性。這兩種受體很相似，它們位于細(xì)胞外，有簡(jiǎn)短的、含有絲-蘇氨酸保守序列的結(jié)構(gòu)域，這是一個(gè)信號(hào)接受的區(qū)域，相對(duì)應(yīng)于這一接受區(qū)域，在細(xì)胞內(nèi)含有一段具絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的區(qū)域（一個(gè)具有重復(fù)的甘氨酸和絲氨酸的氨基酸序列）［3］。在哺乳動(dòng)物中，已經(jīng)鑒定了7種Ⅰ型受體和5種Ⅱ型受體，Ⅰ型受體決定了信號(hào)傳遞的特異性，BMPⅠ型受體又可分骨形成蛋白受體ⅠA（bone morphogenetic protein receptorⅠA，BMPRⅠA，又名ALK3）、BMPRⅠB（又名ALK6）、ACTRⅠA（又名ALK2）等，Ⅱ型受體包括ACVRⅡA、ACVRⅡB、BMPR2［4］。

TGF-β超家族傳導(dǎo)的信號(hào)途徑主要有兩條，即Smad途徑和由TAK1介導(dǎo)的p38MAPK途徑。Smad途徑主要與細(xì)胞分化有關(guān)，而TAK1途徑則主要和細(xì)胞凋亡有關(guān)［5］。轉(zhuǎn)錄因子ATF2是AKT1和Smad共同的下游信號(hào)分子。有研究發(fā)現(xiàn)BMPRⅠA等活化的Smad1能通過(guò)降低ATF2的活性而負(fù)調(diào)控p38MAPK調(diào)節(jié)通路，而由TAK1介導(dǎo)的p38MAPK途徑是BMPRⅠA下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)［6，7］，故BMPRⅠA基因敲除時(shí)p38MAPK介導(dǎo)的凋亡通路可能被正調(diào)控而活化。在胚胎時(shí)期，細(xì)胞凋亡是保證個(gè)體正常發(fā)育所必需的，但若細(xì)胞凋亡規(guī)律失常，個(gè)體發(fā)育也將出現(xiàn)異常甚至引起死亡［8］。晶狀體、神經(jīng)管發(fā)育分化過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子Pax6、Six3、Sox2受成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和BMP信號(hào)的調(diào)控［9］。研究發(fā)現(xiàn)BMP通過(guò)調(diào)節(jié)Pax及HLH基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)背腹神經(jīng)管、中間神經(jīng)管的發(fā)育分化，從而對(duì)眼組織發(fā)育、分化產(chǎn)生重要影響［10］。本研究對(duì)BMPRⅠA在晶狀體內(nèi)條件敲除后晶狀體發(fā)育所發(fā)生的變化進(jìn)行觀察，從而豐富晶狀體的發(fā)育規(guī)律，對(duì)將來(lái)進(jìn)一步了解胚眼的發(fā)育誘導(dǎo)有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及分組：實(shí)驗(yàn)用BMPRⅠA基因條件敲除小鼠alk3fl/fl；lecre和alk3fl/+；lecre。由美國(guó)南加州大學(xué)惠贈(zèng)，在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁育、飼養(yǎng)。雌雄按2∶1比例合籠，母鼠alk3fl/fl配公鼠lecre alk3fl/+或者母鼠alk3fl/+配公鼠lecre alk3fl/fl，產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)組lecre alk3fl/fl，對(duì)照組為lecre alk3fl/+。每天早6點(diǎn)觀察雌鼠陰部，將發(fā)現(xiàn)有陰道栓的孕鼠分籠飼養(yǎng)，并記做胚胎天數(shù)為0.5 d（E0.5 d），標(biāo)簽注明懷孕日期。取胎齡E13.5 d、E15.5 d的小鼠胚胎作為實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各3只，獲取胚鼠眼球，4%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片備用。

1.1.2 主要試劑：一抗：SC-9305 bmp7（羊源抗體），二抗：IF-0314 aG0IgG/FITC，均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 組織包埋：在胚胎天數(shù)達(dá)到E13.5 d、E15.5 d時(shí)，取不同孕期的孕鼠，分組標(biāo)記，分別斷髓處死，浸入75%乙醇消毒3 min，然后取出孕鼠放入一干凈平皿中，無(wú)菌條件下剖腹取出胚胎（同期胚胎不少于6～12個(gè)），撕去胎囊，小心用眼科剪鑷分離出胚胎，并移至另一消毒平皿中，其中預(yù)先放冰PBS液，DEPC-PBS洗2次，鼠尾另作保留用于PCR，4%PFA固定，過(guò)夜，石蠟包埋。

1.2.2 PCR鑒定基因型：把胎鼠的編號(hào)標(biāo)好，取鼠尾做PCR，引物設(shè)計(jì)：Cre-FP：TAATCGCCATCTTCCAG CAG；Cre-RP：CTCTGGTGTAGCTGATGATC；ALK3-FX2：GCAGCTGCTGCTGCAGCCTCC；ALK3-FX4：TGGCTACAATTTGTCTCATGC，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共計(jì)20 μL：2.0 μL的10×Buffer，1.6 μL的5 mmol/L Mg-Cl，1.6 μL的25 mmol/L dNTP，0.7 μL的10 μmol/L OVG34，0.7 μL的10 μmol/L OVG35，0.5 μL的10 μmol/L MHC-5，0.5 μL的10 μmol/L Cre-3，0.1 μL的Taq，0.8 μL的DNA，再加ddH2O 11.5 μL補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性1 min，再60℃退火1 min，72℃再延伸1 min，上述循環(huán)共38個(gè)，最后72℃延伸10 min?；蛐丸b定：取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物5 μL，用2%瓊脂糖凝膠電泳，以Golden view作為分子質(zhì)量標(biāo)記物。小鼠尾部組織瓊脂糖凝膠電泳基因型片段：基因缺失型130 bp，純合子130 bp和350 bp，雜合子350 bp，檢測(cè)出的130 bp條帶為基因片段alk3fl/-；檢測(cè)出的350 bp條帶為基因片段Cre，按此基因條帶可以鑒別出各個(gè)基因型小鼠。

1.2.3 HE染色：烤片30 min，然后二甲苯浸泡10 min，無(wú)水乙醇浸泡5 min（無(wú)水乙醇量要大于二甲苯量），95%乙醇浸泡5 s，90%乙醇浸泡5 s，80%乙醇浸泡5 s，自來(lái)水沖洗。蘇木精浸泡5～10 min，自來(lái)水沖洗，伊紅浸泡2～3 min，自來(lái)水沖洗，95%乙醇浸泡數(shù)秒，無(wú)水乙醇浸泡5 min，二甲苯浸泡10 min，擦干液體，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫熒光：石蠟切片常規(guī)脫蠟，枸櫞酸緩沖洗，微波抗原修復(fù)，蒸餾水沖洗，PBS浸泡3 min×2次，4%過(guò)氧化氫室溫孵育20 min以清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS浸泡3 min×2次，正常羊血清室溫孵育20 min，封閉非特異性抗原，吸去羊血清，然后加入一抗SC-9305 bmp7（羊源抗體），稀釋比1∶10，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，加入二抗IF-0314 aG0IgG/FITC（抗羊），稀釋比1∶500，避光孵育1 h， PBS洗3次，磷酸甘油封片，熒光鏡下觀察，以PBS替一抗作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1BMPRⅠA晶體內(nèi)條件敲除后晶狀體的形態(tài)學(xué)變化

BMPRⅠA在晶體的發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用，但BMPRⅠA的缺失并不會(huì)導(dǎo)致晶體發(fā)育的缺失。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，晶體的形態(tài)學(xué)變化差異從E13.5 d開(kāi)始可以分辨，在E15.5 d已經(jīng)有了顯著差異，但實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有晶體的發(fā)育。胚眼組織石蠟切片后，HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 眼球切片HE染色×20Fig.1 Section of the embryonic eyes was stained with HE×20

2.2BMPRⅠA晶體內(nèi)條件敲除后BMP7在晶體內(nèi)的表達(dá)變化

BMP7在胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)于晶體中，而且其表達(dá)受BMPRⅠA的影響。對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，BMP7在晶體內(nèi)的表達(dá)顯著減少，尤其在胚胎發(fā)育的中后期（E13.5 d～E15.5 d）；而在對(duì)照組中BMP7的表達(dá)則不受影響。胚眼組織石蠟切片后，免疫熒光檢查的結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 眼球切片BMP7表達(dá)的免疫熒光染色×20Fig.2 The BMP7 expression was detected in sections of embryonic eyes by immunofluorescence assay×20

3 討論

晶體的發(fā)育最初起自晶體基板——與視泡相接觸的表皮外胚層的增厚，晶體基板形態(tài)學(xué)上的明顯形成與特定的組織優(yōu)先蛋白（晶狀體蛋白）的表達(dá)同時(shí)發(fā)生。晶狀體蛋白在晶體中的高水平表達(dá)，對(duì)晶體透明度的產(chǎn)生和維持是必要的，晶體基板和視泡的一致性內(nèi)陷導(dǎo)致了晶體泡和雙層視杯的形成，視杯的內(nèi)層形成神經(jīng)視網(wǎng)膜，外層形成視網(wǎng)膜色素上皮，當(dāng)晶體基板從表皮外胚層分離形成晶體泡時(shí)，晶體泡上面的表皮外胚層就形成了未來(lái)的角膜上皮［11］。晶體泡好似一個(gè)球形體，有一個(gè)很大的中央腔，腔內(nèi)充滿原始的晶體纖維細(xì)胞，其來(lái)自于晶體泡后部的延伸，晶體泡前部的細(xì)胞將形成晶體上皮細(xì)胞，晶體上皮中央?yún)^(qū)域分裂活躍的細(xì)胞向中緯線部移行，它們?cè)傺由欤只癁槎?jí)晶體纖維，最后分化截止的晶體纖維細(xì)胞失去了細(xì)胞器，從而使晶體透明［12］。

晶狀體是研究哺乳動(dòng)物發(fā)育的理想系統(tǒng)，與周圍組織相對(duì)隔離，特別是細(xì)胞成分單純，由晶狀體囊膜、晶狀體上皮細(xì)胞和最終分化形成的晶狀體纖維組成，其前囊后方是一單層上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞發(fā)生有絲分裂，新生的細(xì)胞向赤道部移行，同時(shí)開(kāi)始了晶狀體纖維分化過(guò)程，晶狀體纖維細(xì)胞由上皮細(xì)胞伸長(zhǎng)形成。很多晶狀體蛋白基因幾乎僅僅在晶狀體細(xì)胞表達(dá)，因此可以應(yīng)用這些基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型［13］。所以晶狀體活體模型將排除體外實(shí)驗(yàn)的各種干擾因素，為研究細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)與組織分化提供了一個(gè)獨(dú)一無(wú)二的機(jī)會(huì)。

BMP/TGF-β通路：BMP/TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控晶體發(fā)育的多個(gè)階段，大量BMP和TGF-β配體以及它們的跨膜蘇氨酸激酶受體被表達(dá)在晶體和外周組織，在與配體結(jié)合之上，在Ⅰ型和Ⅱ型受體二聚體之間形成一個(gè)復(fù)合物，伴隨著Ⅱ型受體轉(zhuǎn)磷酸化Ⅰ型受體［14］。被激活的Ⅰ型受體與銜接蛋白相互作用，可招募Smad蛋白，在TGF-β級(jí)聯(lián)反應(yīng)中細(xì)胞質(zhì)Smad2和Smad3被磷酸化，形成有共同介質(zhì)Smad4的細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物，隨后轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核。在BMP通路，磷酸化的Smad1/4/5與Smad4粘連。通過(guò)識(shí)別Smad結(jié)合位點(diǎn)，Smad4/Smad3或Smad4/Smad能激活或抑制轉(zhuǎn)錄，此轉(zhuǎn)錄依賴于它們相互聯(lián)系的染色質(zhì)重建酶，交替的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)能經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜RAS和它的下游目標(biāo)ERK1/2介導(dǎo)，或者經(jīng)過(guò)TAK1/ MFKK1激酶產(chǎn)成活性JNK和P38激酶，這一通路的負(fù)調(diào)控物包括晶狀體蛋白限局性抑制的Smad5、Smad6和Smad7［15］。BMP/TGF-β通路在一定的細(xì)胞背景里進(jìn)行相應(yīng)的操作。與不同BMP/TGF-β因子相結(jié)合的受體的時(shí)空調(diào)節(jié)以及磷酸化Smads的分布對(duì)這一通路的機(jī)制分析提供了策略。雞和老鼠的實(shí)驗(yàn)顯示晶體纖維細(xì)胞的延伸被一個(gè)BMP配體抑制劑所抑制［16］。原始晶體纖維的分化也被ALK6的顯性陰性形式的過(guò)表達(dá)所抑制。BMPRⅠA的失活在預(yù)期的晶體外胚層中導(dǎo)致了缺陷，此缺陷促成了受體在纖維細(xì)胞分化后期和晶體上皮細(xì)胞增殖與存活中的作用。BMP和TGF-β配體不只被其他的眼部細(xì)胞產(chǎn)生去調(diào)節(jié)晶體纖維細(xì)胞的分化，晶體本身也能作為TGF-β通路中心去控制來(lái)源于中樞神經(jīng)區(qū)的眼部組織的發(fā)育［17］。

小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中BMP7表達(dá)于眾多胚胎組織，尤其是上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞相互作用介導(dǎo)的組織發(fā)育。眼組織源于神經(jīng)外胚葉、表皮外胚葉和中胚葉，發(fā)育過(guò)程復(fù)雜，并存在各組織間的相互作用。BMP幾乎與所有眼組織發(fā)育密切相關(guān)，尤其是晶狀體和視網(wǎng)膜，涉及復(fù)雜的信號(hào)和組織間的相互作用，是研究的重點(diǎn)［18］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)BMP7是視泡發(fā)出的晶狀體板和角膜上皮細(xì)胞的誘發(fā)信號(hào)分子，一些學(xué)者對(duì)發(fā)育早期視網(wǎng)膜、晶狀體與BMP三者之間的關(guān)系進(jìn)行研究與推測(cè)：在發(fā)育早期視網(wǎng)膜產(chǎn)生BMP7和BMP結(jié)合蛋白，假想其均分泌至玻璃體，晶狀體依賴BMP7誘發(fā)。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了BMPRⅠA在晶體的發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用，但BMPRⅠA的缺失并不會(huì)導(dǎo)致晶體發(fā)育的缺失。BMPRⅠA晶體內(nèi)條件敲除的小鼠隨著胚齡的增加其晶體的形態(tài)學(xué)變化日益明顯，雖然有晶體的發(fā)育，但發(fā)育不良、形態(tài)缺陷明顯［19］。BMP7在胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)于晶體中，我們觀察到其表達(dá)一定程度上受BMPRⅠA的影響，在BMPRⅠA晶體內(nèi)條件敲除的小鼠中，BMP7在晶體內(nèi)的表達(dá)顯著減少，尤其在胚胎發(fā)育的中后期。本實(shí)驗(yàn)為胚胎誘導(dǎo)的學(xué)說(shuō)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)行了有意義的嘗試。關(guān)于BMPRⅠA和BMP7之間的具體作用機(jī)制，我們還需要在將來(lái)的研究中進(jìn)一步探討。

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（編輯陳姜）

Influence of Bone Morphogenetic Protein ReceptorⅠA Conditional Knockout in Lens during Embryonic Eye De?velopment

ZHAOQi1，ZHAOJiang-yue2，ZHANGJin-song2
（1.DepartmentofOphthalmology，Second Affiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116023，China；2.DepartmentofOphthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo study the process of embryonic development from protein and molecular biology level，and investigate the function of Bone Morphogenetic Protein ReceptorⅠ（BMPRⅠ）A during development of the vertebrate eye.MethodsAlk3fl/fl lecre and alk3fl/+lecre mice which hasBMPRⅠAconditionalknockoutin lensregion were used in this experiment.3 Cre-positive（conditionalknockout，CKO）and 3 Cre-negative offspring（WT）were generated by mating Cre-positive mice with Cre-negative mice.Embryos were fixed and embedded in paraffin.Sections were processed for hematoxylin and eosin staining.In immunofluorescence analysis，primary antibody sc-9305 bmp7 was used for immunofluorescence detection.IF-0314 aG0IgG/FITC was adopted as secondary antibody.The bright field images and the fluorescent images were obtained.Re?sultsComparing the BMPRⅠA lens conditional knockout mice with the control subjects，morphological difference of lens was first observed in E13.5，and significant differences were present in the E15.5 d，but both the experimental group and control group showed lens growth.In the mice ofBMPRⅠAlens conditionalknockout，bone morphogenetic protein 7（BMP7）expression was significantly reduced in lens，especially in the laterperiod of the embryonic development（E13.5 d-E15.5 d）；while BMP7 expression was not affected in the control group.ConclusionBMPRⅠAplayed an important regulatory role in development of lens，the loss ofBMPRⅠAresulted in dysplasia and morphological defects，but did not cause the lack oflens formation.Bone morphogenetic protein 7 expressed in lens during embryogenesis，and its expression wasinfluenced byBMPRⅠA.

BMPRⅠA；bone morphogenetic protein 7；lens；embryonic development

R321

A

0258-4646（2014）03-0209-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（30872836）；遼寧省自然科學(xué)基金（201102054）

趙琪（1971-），男，主任醫(yī)師，博士. E-mail：zhaoqi0219@126.com

2013-12-16

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